李 蕊 徐小明

（1.浙江省血液中心檢測中心 浙江 杭州 310052；2.浙江省疾病預防控制中心理化檢驗所 浙江 杭州 310051）

1 引言

由于技術和經(jīng)濟等方面的原因，很多巧克力產(chǎn)品中部分可可脂被其他物質取代［1］，如乳脂肪、代可可脂、類可可脂等。我國于2004年7月起正式執(zhí)行的《巧克力及巧克力制品》國家標準中明確規(guī)定巧克力中非可可植物脂肪的添加量不得超過5%［2］，但該標準缺乏具體的檢測方法，只能根據(jù)廠家提供的原始配料進行估算。因此要通過檢測巧克力中脂肪酸特點來達到測定非可可植物脂肪的目的，首先應排除乳脂肪對檢測結果的干擾。

對此，國內外學者進行了大量的研究，主要集中在對巧克力中甘油三酯和脂肪酸的檢測兩個研究方向。ISO 23275－1和ISO 23275－2［3］中公布了通過檢測甘油三酯來對黑巧克力中摻入的類可可脂含量進行檢測的方法，但由于乳脂肪中的甘油三酯會對類可可脂的定量測定起到干擾作用，因此這種方法不適用于牛奶巧克力的檢測。也有學者通過測定乳脂肪中的丁酸及其與肉豆蔻酸、棕櫚酸的比率來測定乳脂肪的含量［5］，但由于丁酸具有不穩(wěn)定性，會隨時間和環(huán)境的變化發(fā)生量的變化，因而可能造成定量不準確。本研究通過測定乳脂肪中的脂肪酸發(fā)現(xiàn)C14：1僅在乳脂肪中存在，且在各種乳脂肪中含量穩(wěn)定，是很好的鑒別標準物。同時本方法通過較為簡便的計算方法即可達到準確定量的目的，不失為一種檢測巧克力中乳脂肪含量的可行方法，并為進一步測定巧克力中非可可植物脂肪的含量奠定了基礎。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料：儀器與試劑Agilent 6890N 氣相色譜儀，7683自動進樣器，HP ChemStation 化學工作站（美國安捷倫公司）；分析天平AL104－IC（梅特勒－托利多儀器有限公司）；旋渦混合器WH－861（太倉市華利達實驗設備有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀Laborota 4003Control（德國Heidolph 公司）；電熱恒溫干燥箱ED－53（德國Bindent GmbH 公司）；微量移液器（瑞士SOCOREX 公司）。試劑：甲醇、乙醇、正己烷、無水乙醚、，均為色譜純，氫氧化鉀、氯化鈉均為分析純，氨水、2mol／L 鹽酸甲醇溶液。

2.2 標準品的配置：量取1ml 10.0mg／ml的37種脂肪酸甲酯混合標準品，用正己烷定容于10ml棕色容量瓶中，配制成質量濃度為1000 mg／L的標準儲備液，于－20℃下保存。取各標準儲備液適量，用正己烷稀釋配制所需濃度的混合標準工作液，密封，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 實驗方法

2.3.1 色譜條件：選用CP－Sil 88FAME 毛細管石英柱（100in×0.25Inm×0.20m），F(xiàn)ID 檢測器，載氣為高純氮氣，柱溫60℃保持2min后以15℃／min升溫到100℃，再以4℃／min升溫到230℃保持15分鐘；進樣口溫度為250℃，檢測器溫度280℃，分流比1：5；載氣流量1.5ml／min。

2.3.2 脂肪酸提取方法：準確量取液體試樣10ml，加入2ml氨水，置于65℃水浴15min，取出輕搖，冷至室溫，在制備好的樣品中加入10 ml乙醇，混勻。加入12.5ml無水乙醚，加塞振搖1min。在加入12.5ml正己烷，加塞振搖1min，靜置、分層，有機相轉入磨口平底燒瓶中，重復操作兩次。合并抽提液于磨口平底燒瓶中，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至干。

2.3.3 脂肪酸的甲酯化：準確稱取10mg（精確至0.1mg）提取樣品，加入0.7ml 1mol／L的KOH／CH3OH 溶液，混勻，置于60℃水浴中振蕩3min，待冷卻至室溫，加入1ml 2mol／L 的HCl／CH3OH 溶液，混勻，置于50℃烘箱中反應15min后，待冷卻至室溫，加入3ml飽和NaCl溶液，1ml正己烷，混勻，離心，取上清液待測。

3 結果與討論

3.1 巧克力中乳脂肪的定性鑒別：通過對乳脂肪、可可脂、類可可脂、月桂酸型代可可脂、非月桂酸型代可可脂及各種植物油的脂肪酸進行檢測，發(fā)現(xiàn)C14：1只存在于乳脂肪中，見圖1，且C14：1／C12：0的范圍在0.2～0.3之間，通過對其中各種脂肪酸含量特點的分析發(fā)現(xiàn)，兩種代可可脂中C14：1和C12：0 的含量與乳脂肪和可可脂相差較大，因此根據(jù)C14：1／C12：0的范圍較容易將加入了代可可脂的牛奶巧克力鑒別開來，而類可可脂中C14：1和C12：0的含量與可可脂極為相似，因此還不能鑒別牛奶巧克力中加入了類可可脂的情況。見表1。

表1 油脂中C12：0及C14：1的含量及其比值

圖1 純可可脂、乳脂肪、月桂酸型代可可脂、類可可脂疊加色譜圖

3.2 乳脂肪的定量檢測：通過按5%、10%、15%、20%和30%的比例向純可可脂中摻入乳脂肪，得到各種脂肪酸的線性方程，根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)對定量方程進行篩選。首先，從表2中的數(shù)據(jù)可以看出，同一種脂肪酸的含量在不同乳脂肪和可可脂中存在一定的差異，為了削弱這種差異而達到準確定量的目的，需選擇相對標準差較小的指標，因此將C14：0這一指標排除。其次，在相對標準差滿足條件的同時應考慮選擇線性相關性好的指標，據(jù)此將C16：0 這一指標排除。最終確定C14：1、C16：1 和C18：0這三個指標為計算巧克力中乳脂肪含量的指標，可以通過這一系列線性方程分別求出加入的乳脂肪的量，再求其平均值作為乳脂肪的加入量。同時我們也對這三個定量方程的準確性做了進一步的驗證，見表3。用其對三個不同的模擬組進行計算，結果的相對誤差在0.5%～26%之間，能夠滿足檢測的要求。

表2 乳脂肪和可可脂中五種脂肪酸成分的相對標準偏差及線性回歸方程

表3 模擬摻偽巧克力中乳脂肪測量值與真值比較

從定性的結果來看我們不能將加入了類可可脂的牛奶巧克力鑒別開來，因此我們對加入類可可脂的情況也進行了模擬，向含有一定量乳脂肪的可可脂中分別加入5%和10%的類可可脂，見表3。根據(jù)檢測結果可以看出，在加入類可可脂的情況下，運用上述三個指標對其中加入乳脂肪的量進行計算，結果也是可以滿足檢測要求的。這樣就實現(xiàn)了對非代可可脂巧克力中乳脂肪含量的準確檢測。

當C14：1／C12：0的比值超出0.2～0.3這個范圍時，說明巧克力中有代可可脂的加入，此時對乳脂肪含量的檢測只能用C14：1的定量方程對其進行計算。

4 小結

雖然飼料、地域、季節(jié)等因素會使牛奶中乳脂肪的某些成分存在一定的差異，但仍有一部分脂肪酸所占的百分含量比較穩(wěn)定，本研究較好的利用了這一特征，成功的建立了一種檢測巧克力中乳脂肪含量的氣相色譜方法。并且本方法具有易于操作、計算方法簡單等優(yōu)點，為進一步檢測巧克力中非可可植物油的含量打下了良好的基礎。

［1］ Lippm，Anklame.Review of cocoa butter and alternative fats for use in chocolate－part A.Compositional data.Food Chemistry，1998，62（1）：73－97

［2］ GB－T 19343－2003 巧克力及巧克力制品［S］.

［3］ ISO 23275－1.Animal and vegetable fats and oils－Cocoa butter equivalents in cocoa butter and plain chocolate－Part 1：Determination of the presence of cocoa butter equivalents.2006

［4］ ISO 23275－2.Animal and vegetable fats and oils－Cocoa butter equivalents in cocoa butter and plain chocolate－Part 2：Quantification of cocoa butter equivalents.2006

［5］ MUUSE B，MARTENS R.Mixtures of milk fat with non－milk fat－Determination of the milk fat content［J］.Int.Dairy Fed.Bull.1993，285：65－69