黃麗華，孫國章，李鳳麗

（1.天津雅昂醫(yī)藥國際化發(fā)展促進有限公司，天津300410； 2.天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司，天津300410；3.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津300193）

血清藥理學在中藥復方配伍研究領(lǐng)域中的應用現(xiàn)狀

Application situation of serum pharmacology in the research fiecd of Chinese herbs compound compatibility

黃麗華1，孫國章2，李鳳麗3

（1.天津雅昂醫(yī)藥國際化發(fā)展促進有限公司，天津300410； 2.天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司，天津300410；3.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津300193）

中藥藥理學；血清藥理學；研究方法

血清藥理學是日本學者田代真一在1984年第一屆和漢醫(yī)學會上首次提出［1］，指在動物經(jīng)口服給藥一段時間后采血，分離血清，用此含藥血清進行體外藥理實驗的一種實驗方法，它為科學地闡明中藥復方的作用及其機制提供了新的研究理論［2］。1997年以王喜軍為代表的科學研究者將中藥血清藥理學的概念與理論方法引入中國醫(yī)藥研究領(lǐng)域，中藥血清藥理學方面的研究隨之開展起來。血清藥理學較中藥直接作用于體外實驗的傳統(tǒng)方法更符合中藥在體內(nèi)代謝的實際情況，為中藥藥理研究提供了新的思路和途徑，故在中藥尤其是中藥復方的藥理學研究方面顯示出重要作用［3］。中藥血清藥理學在神經(jīng)、心血管、呼吸、免疫、消化、生殖、泌尿、骨骼系統(tǒng)以及在抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒等方面都有很好的應用，為中藥復方藥理作用的研究提供了良好的方法［4］。本文就近年來關(guān)于中藥血清藥理學在中藥復方配伍研究領(lǐng)域中的應用現(xiàn)狀進行綜述。

1 血清藥理學在中藥復方研究中的應用

1.1 對神經(jīng)系統(tǒng)作用的研究

巴寅穎等［5］采用RP-HPLC法測定大鼠血清中遠志咄酮Ⅲ的濃度來考察遠志和開心散中遠志咄酮Ⅲ在記憶障礙模型大鼠體內(nèi)的藥動學特性，發(fā)現(xiàn)復方配伍可延長有效血藥濃度時間、提高生物利用度、加速吸收等，調(diào)節(jié)其藥動學特性能更好地發(fā)揮藥效。姜英鳳等［6］通過觀察抑郁情緒大鼠模型給藥血清對離體海馬神經(jīng)元γ氨基丁酸B2受體（GABABR2）蛋白表達的影響實驗研究，發(fā)現(xiàn)抑郁情緒模型大鼠血清可誘導大鼠海馬神經(jīng)元GABABR2蛋白表達上調(diào)，舒郁膠囊、能是通過降低海馬神經(jīng)元GABABR2蛋白表達發(fā)揮抗抑郁作用。

1.2 對呼吸系統(tǒng)的作用研究

甘雨等［7］研究射干提取物含藥血清對豚鼠離體氣管平滑肌收縮功能的影響發(fā)現(xiàn)射干提取物含藥血清對組胺（His）引起的氣管平滑肌收縮反應有一定拮抗作用，其中劑量（0.46 g/kg）3 min、5 min、10 min解痙率分別為44.29%、45.27%和48.30%；高劑量（0.92 g/kg）3 min、5 min解痙率分別為31.17%和31.83%，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），藥物與標本接觸5 min效果最好。得出射干提取物含藥血清對His引起的氣管平滑肌收縮反應具有一定的拮抗作用的結(jié)論。

1.3 對消化生殖系統(tǒng)的作用研究

趙志明等［8］觀察不同劑量的中藥何首烏飲對大鼠卵巢顆粒細胞端粒酶活性的影響，探討其在調(diào)節(jié)卵泡微環(huán)境過程中所起的作用。制備大鼠排卵前卵巢模型，收集顆粒細胞（GC）分別與雌性SD幼鼠空白血清及含不同劑量何首烏飲的含藥血清在體外共同培養(yǎng)。用TRAP-ELISA方法分析GC的端粒酶活性，運用流式細胞術(shù)分析GC凋亡、壞死情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各劑量組何首烏飲含藥血清可明顯上調(diào)GC端粒酶活性，與對照組比較，中、高劑量何首烏飲含藥血清能夠顯著提高GC端粒酶活性（P＜0.05）。隨著中藥血清藥物劑量的增加，顆粒細胞凋亡率逐漸下降，與對照組比較，中、高劑量組何首烏飲含藥血清均能夠顯著降低離體GC的凋亡率（P＜0.01），各含藥血清組細胞壞死率雖較對照組高，但與各組比較差別無統(tǒng)計學意義。由此認為何首烏飲可上調(diào)離體培養(yǎng)的大鼠卵巢GC端粒酶活性、抑制凋亡，對卵泡局部微環(huán)境的調(diào)節(jié)可能是其調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸的重要靶點之一。

1.4 對泌尿系統(tǒng)的作用研究

王喜軍等［9］通過研究六味地黃丸血中移行成分對氫化可的松致大鼠腎虛動物模型的保護作用，闡明六味地黃丸補腎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。初步確定所分離得到的六味地黃丸的血中移行成分是六味地黃丸補腎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，其中以莫諾苷、獐牙菜苦素和馬錢子苷的作用最為明顯，是補腎的核心成分。

1.5 對骨骼系統(tǒng)作用的研究

王喜軍等［10］首先采用中藥血清藥化學方法從六味地黃丸含藥血清中分離鑒定出8個移行成分，然后用血清藥理學方法發(fā)現(xiàn)其中莫諾苷、獐牙菜苦素和馬錢子苷混合物的含藥血清對氫化可的松致大鼠腎虛動物模型的保護作用最明顯，是補腎的核心藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，而且三者混合物的含藥血清對大鼠成骨細胞的促增殖作用也很明顯，初步確認其為治療骨質(zhì)疏松的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［11］。

1.6 對心腦血管系統(tǒng)的作用研究

陳一江等［12］應用溫心湯藥物血清干預離體蛙心模型，觀察溫心湯藥物血清對離體蛙心收縮活動的影響。通過實驗發(fā)現(xiàn)藥物濃度與心率呈極顯著量效關(guān)系，藥物濃度與平均肌張力呈極顯著量效關(guān)系。

楊廣等［13］采用SD大鼠灌胃通冠膠囊水煎劑，每日1次，連續(xù)9 d，制備含藥血清；培養(yǎng)并傳代兔的血管平滑肌細胞（VSMC），采用噻唑藍MTT比色法觀察通冠膠囊含藥血清對VSMC增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通冠膠囊可以明顯抑制VSMC增殖。

1.7 對免疫功能影響作用的研究

石強［14］通過比較粘魚須、威靈仙、棉團鐵線蓮對細胞免疫和體液免疫的影響發(fā)現(xiàn)粘魚須可以作為祛風濕藥威靈仙使用。其方法為選擇影響玫瑰花環(huán)形成、T細胞亞群數(shù)量、遲發(fā)型變態(tài)反應等3個細胞免疫的指標和影響抗體形成細胞數(shù)量、血清溶血素數(shù)量等2個體液免疫的指標進行比較。結(jié)果黏魚須、威靈仙、棉團鐵線蓮均能抑制T細胞功能，降低機體細胞免疫反應能力。

1.8 對其他方面的影響

中藥血清藥理學還常應用于抗腫瘤［15］、抗病毒［16］、抗炎等［17-18］其他很多方面?？傊?，中藥血清藥理學方法作為一種新的藥理學方法，為中藥藥理研究提供了嶄新的思路，為復方的深入研究提供了一條行之有效、不可替代的途徑，推動了中藥藥理學的發(fā)展，提高了體外實驗的可信性和可靠性，并使以前無法進行的研究成為可能。

2 血清藥理學在中醫(yī)藥領(lǐng)域中的研究思路及方法

2.1 實驗研究準備工作

飲食可能影響中藥復方體內(nèi)動力學和臨床療效，如食物對口服小柴胡湯者體內(nèi)甘草酸、甘草次酸和黃芩素等吸收影響明顯。因此應根據(jù)中藥復方的功效特點、實驗要求，決定給藥前禁食與否，并擬訂給藥后采血時間。目前，給藥前實驗動物多禁食6 h～12 h，不禁水。

2.2 給藥途徑的選擇

一般在制備含藥血清時，供體動物的給藥途徑應該與臨床給藥途徑一致，以避免由于給藥途徑的不同帶來結(jié)果的差異。目前中藥復方多用口服（灌胃）給藥來制備含藥血清，由于中藥新劑型不斷產(chǎn)生，在實驗中可根據(jù)實際情況，嘗試使用黏膜、呼吸道等給藥途徑制備含藥血清。

2.3 受試動物的選擇

小鼠、大鼠、豚鼠等為常用實驗動物，不同種屬、性別、年齡的動物血清成分不同，其實驗結(jié)果也會有一定差異。王威等［19］觀察中藥續(xù)斷含藥血清對不同性別大鼠成骨細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)雌性大鼠的血清中作用表達強于雄性大鼠。為此，陸慧晶［20］認為，選擇動物時應盡量選與人類生物特性近似的物種，制備血清的動物應與獲取離體器官、組織細胞的動物相一致，從而縮小或避免動物血清之間以及動物血清和人類血清之間在理化、生物等特性上的差異，提高實驗結(jié)果的可靠性。在動物的類型上，多用正常的動物，但中藥復方在正常生理臟器與病理臟器之間其藥物本身及機體所產(chǎn)生的變化可能不完全相同，而臨床服用藥物的對象多為病理狀態(tài)的患者，因此病理狀態(tài)下藥物血清的作用尚需進一步探討。

2.4 給藥劑量、給藥次數(shù)、給藥時間等方案的設(shè)定

在進行中藥血清藥理實驗之前必須確定合適的給藥方案。血清藥理學很重要的一個關(guān)鍵問題是給藥劑量、給藥次數(shù)、給藥時間的確定。目前常用的方法有：1次給藥或間隔2 h～4 h給藥，或1次/d～3次/d，連續(xù)3 d～l0 d。同一給藥方案連續(xù)數(shù)日給藥較1次給藥有明顯差異，主要與藥物誘導機體產(chǎn)生內(nèi)源性生物活性物質(zhì)有關(guān)，主張多次給藥。國內(nèi)很多學者提出每天給藥3次，連續(xù)5 d～7 d的給藥法。實驗中給藥劑量均以實驗動物體重、種屬而定。

劉倩等［21］進行化濁行血湯含藥血清血管內(nèi)皮保護作用及其體內(nèi)給藥時效差異的研究中，通過化濁行血湯不同給藥方案、藥物不同給藥劑量、藥后不同取血時間所得的藥物血清為受試對象，培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞，進行缺氧復氧實驗，研究結(jié)果表明以2次/d灌胃，連續(xù)3 d，并在末次灌胃90 min后取血所得藥物血清藥理效應最佳。可見，合理的給藥方案對獲得科學合理、真實可靠的實驗結(jié)論是十分必要的。采用中藥血清藥理學方法開展研究，有必要先確定受試制劑的給藥劑量、給藥次數(shù)、給藥時間等方案，這樣所取含藥血清才能較好地反映藥物所具有作用［22］。

2.5 采血時間的確定

理想的采血時間應落在給藥的峰濃度時間段內(nèi)。但由于中藥成分復雜，不同成分給藥后達峰值時間不同，因此應根據(jù)實驗動物消化特點和中藥吸收轉(zhuǎn)化特點確定取血時間范圍。如大鼠一般1 h～2 h可達到血藥濃度峰值，此時的血清即為最佳含藥血清，一般采血時間為末次給藥的30 min～3 h間?，F(xiàn)今最可靠的方法是先通過對少量動物進行預實驗，將不同時間的含藥血清進行比較后再確定采血時間［23］。

2.6 含藥血清的處理和保存

含藥血清的處理常見有丙酮法、乙醇法、加溫法，含藥血清的保存研究發(fā)現(xiàn)含藥血清經(jīng)長期低溫保存（-20℃，2個月）后藥效顯著降低（P＜0.01），提示含藥血清在保存過程中其中藥有效成分會發(fā)生分解等變化，致使藥效成分含量顯著降低，即使低溫冷凍保存仍影響其藥效。故進行血清藥理學試驗時宜使用新鮮滅活或保存時間較短的含藥血清。

2.7 實驗研究中常遇到的問題及解決方法

受試動物給藥時需按動物的體重給予需實驗的藥物，一般從低劑量分組逐漸增量。注意如加有輔料，要折算成純藥物劑量。

動物血清中含有大量的蛋白質(zhì)、生物堿、抗體、補體等生物活性物質(zhì)，它們會對體外培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生影響，所以實驗前應先進行血清滅活從而減少干擾因素對實驗的影響。

不同種屬、不同年齡的動物對藥物吸收有一定差異，從而影響到血清中含藥成分及其含量。因給藥劑量、采血時間不同，血清中含藥成分及其含量也不盡相同，故必須充分把握好給藥劑量及采血時間。

3 血清藥理學在中藥復方配伍研究領(lǐng)域中存在的問題

中藥血清藥理學是在以往體外實驗的基礎(chǔ)上加以改進而形成的，即以含藥血清代替中藥粗提物進行實驗，具有條件可控性強、揭示藥物作用機制較為深入、重復性好、使用材料少、更接近藥物在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥效的真實過程等優(yōu)點［24］。但從引進我國到現(xiàn)在只有短短的十多年時間，因而存在不少有待進一步改進之處，如在體外培養(yǎng)體系中不可能添加純濃度的血清，而且不是所有的中藥都通過血液起作用，個別是通過部位用藥起到治療作用，這是血清藥理學難以解決的；其次，藥物血清的制備中，由于實驗動物種屬的不同或種屬相同年齡性別的不同，都能引起實驗動物對藥物敏感程度的差異以及對復方藥物中不同組分的吸收、轉(zhuǎn)化、作用靶點的相異，因此實驗動物的種屬和年齡性別的選擇有待規(guī)范［25-27］；再次，血清學自身組分的復雜性至今尚未完全清楚，血清本身復雜的成分會影響體外實驗的結(jié)果，而中藥復方組分也是一個未知體系，兩個未知體系的疊加使原本復雜的體系更加復雜，這無形中限制了中藥血清藥理學在中藥復方中的應用范圍；最后，中醫(yī)診斷疾病的方法和特點是辨證論治，在實驗學中卻往往忽視中醫(yī)內(nèi)涵，如何將辨病論治與辨證論治結(jié)合是血清藥理學現(xiàn)今急需要解決的問題，并且中藥復方并非單一成分發(fā)揮藥理學作用，其實驗穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和標準化也是血清藥理學面臨的問題。

4 血清藥理學在中藥復方配伍研究領(lǐng)域中應用前景展望

血清藥理學起步較晚，盡管它的應用、方法存在不少問題，但作為一門新興方法學，它在復方藥理學研究中具有不可代替的作用，目前已經(jīng)有大量的中醫(yī)藥學實驗建立在血清藥理學的基礎(chǔ)上［28］。國外多采用高效液相色譜法分析復方有效成分，但此種方式不符合復方在人體內(nèi)的作用過程。中藥復方的研究仍在技術(shù)和方法學上存在瓶頸，需要進一步探索，以便更好地研究中藥及復方的作用機制。隨著中藥血清藥理學存在問題的逐步解決，方法更進一步地成熟和完善，它將更廣泛地應用于中藥復方研究領(lǐng)域［23］。

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（編輯：翟春濤）

R285

A

1671-0258（2015）01-0066-04

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項項目（2010ZX09102-201）

黃麗華，學士，E-mail：lfl992610@163.com

李鳳麗，博士，E-mail：lfl992610@163.com