程玉謙，祁偉(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211)

腸桿菌科細(xì)菌外排泵AcrAB-TolC調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

程玉謙，祁偉
(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211)

摘要:AcrAB-TolC外排泵廣泛存在于腸桿菌科細(xì)菌中，其基因表達(dá)水平的提高對臨床菌株多重耐藥起重要作用。細(xì)菌AcrAB-TolC外排泵系統(tǒng)產(chǎn)生多重耐藥性的機(jī)制是將細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的抗生素主動泵出，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降。外排泵AcrAB-TolC的調(diào)控主要有局部調(diào)控和全局調(diào)控兩種方式，調(diào)節(jié)基因AcrR、marOR、ramR及soxRS的突變可以導(dǎo)致AcrAB操縱子過表達(dá)，有助于細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥表型。

關(guān)鍵詞:腸桿菌科;外排泵;調(diào)控機(jī)制;多重耐藥

主動外排機(jī)制對細(xì)菌多重耐藥性的產(chǎn)生起重要作用［1，2］。AcrAB-TolC外排泵由細(xì)菌外膜通道蛋白TolC、內(nèi)膜外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB及膜融合蛋白AcrA組成。其中AcrA位于周質(zhì)間隙，連接AcrB和TolC，以三聚體形式穿越細(xì)菌內(nèi)膜和外膜，主動將菌體內(nèi)的物質(zhì)泵出細(xì)胞外?，F(xiàn)已證實，外排泵AcrABTolC廣泛存在于腸桿菌科細(xì)菌(大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌、產(chǎn)氣腸桿菌、志賀菌等)中，是重要的外排系統(tǒng)，它受局部調(diào)節(jié)因子AcrR及全局調(diào)節(jié)因子MarA-SoxS-Rob系統(tǒng)的調(diào)控［3，4］。本文對腸桿菌科細(xì)菌外排泵AcrAB-TolC調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

1　外排泵AcrAB-TolC對細(xì)菌多重耐藥的作用機(jī)制

外排泵AcrAB-TolC以質(zhì)子驅(qū)動力為能源，通過AcrB捕獲和轉(zhuǎn)運(yùn)底物。AcrB的外周胞質(zhì)發(fā)夾環(huán)具有結(jié)合藥物分子的作用，當(dāng)AcrB與藥物分子結(jié)合時，其構(gòu)象發(fā)生改變，隨之通過級聯(lián)放大效應(yīng)，進(jìn)一步引起AcrA和TolC構(gòu)象改變，AcrB和TolC相互接觸，通道開放。在生理狀態(tài)下，AcrAB-TolC的表達(dá)有助于菌株抵抗腸道的膽鹽、脂肪酸等疏水性物質(zhì)的入侵;但AcrAB-TolC的高表達(dá)表現(xiàn)出對多種化合物的耐受，如各種抗生素(β-內(nèi)酰胺類抗生素、四環(huán)素、氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、甲氧芐啶及喹諾酮類抗生素等)以及其他毒素復(fù)合物(吖叮黃、三氯生、去污劑、染料和有機(jī)溶劑)。外排泵系統(tǒng)可將細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的抗生素主動泵出，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降。近年來研究證實，AcrAB-TolC外排基因高水平表達(dá)對于臨床菌株多重耐藥性有重要作用［5，6］。

2　腸桿菌科細(xì)菌外排泵AcrAB-TolC的調(diào)控方式

外排泵AcrAB-TolC的調(diào)控主要有局部調(diào)控和全局調(diào)控兩種方式，其局部調(diào)控蛋白主要為AcrR，全局調(diào)控蛋白主要有MarA、Rob、SoxS、RamA等。調(diào)節(jié)基因AcrR、MarOR、RamR及SoxRS的突變可以導(dǎo)致AcrAB操縱子的過表達(dá)，有助于細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥表型。

2.1局部調(diào)控AcrR是一種負(fù)性調(diào)控因子，包括215個氨基酸，由位于泵基因上游141 bp的阻遏基因AcrR編碼，與AcrAB啟動子上的24個堿基對構(gòu)成的反轉(zhuǎn)重復(fù)序列結(jié)合，抑制自身及AcrAB基因的表達(dá)。AcrR同轉(zhuǎn)錄抑制子TetR有共同的N末端序列和相似性結(jié)構(gòu)。AcrR折疊形成9個α-螺旋結(jié)構(gòu)，由DNA結(jié)合區(qū)和配體結(jié)合區(qū)組成。N末端的3個螺旋區(qū)形成典型的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，是其與DNA鏈的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)相對保守; C末端區(qū)為底物結(jié)合位點(diǎn)，形成1個配體結(jié)合口袋，能夠調(diào)節(jié)多種配基，表明AcrR是一種多藥結(jié)合蛋白。當(dāng)AcrR與底物結(jié)合后，N端即與DNA鏈分離，啟動AcrAB基因表達(dá)。AcrR抑制子的突變有助于AcrB的過表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，AcrR第45位氨基酸位于螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合區(qū)的中間，這一位點(diǎn)相對保守，其突變會導(dǎo)致AcrAB表達(dá)增加，在抗生素耐藥性中起重要作用［7］。AcrAB的過表達(dá)不依賴于AcrR的活性，但是當(dāng)AcrAB過表達(dá)后，AcrR的活性在調(diào)節(jié)AcrAB的表達(dá)中可能起到重要作用。沙門菌中AcrR的突變導(dǎo)致75位異亮氨酸和76位谷氨酸的復(fù)制，有助于AcrAB的過表達(dá)。

2.2全局調(diào)控調(diào)節(jié)因子MarA、SoxS、Rob及RamA屬于AraC/XylS家族，共同構(gòu)成MarA-SoxS-Rob調(diào)控系統(tǒng)，作為單體結(jié)合由20 bp組成的非對稱序列AYNGCACNNWNNRYYAAAYN (N代表任何堿基，R代表A或G，W代表A或T，Y代表C或T)，這個結(jié)合位點(diǎn)稱為marbox。marbox出現(xiàn)在調(diào)節(jié)基因(如AcrAB、TolC、MarRAB)啟動子上游; SoxS和MarA結(jié)合到marbox的不同基因，不同程度地激活A(yù)crAB轉(zhuǎn)錄而提高外排泵表達(dá)。調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平的提高同操縱子的基因突變或誘導(dǎo)劑的結(jié)合位點(diǎn)突變有關(guān)。此外，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之間也存在交叉調(diào)節(jié)作用，如SoxS的缺失可以降低MarA的表達(dá)，反之亦如此。

2.2.1MarRAB操縱子Mar操縱子是細(xì)菌對外界環(huán)境壓力反應(yīng)的調(diào)控中心。Gorge等于1983年首次在大腸埃希菌染色體上發(fā)現(xiàn)Mar操縱子，后證實其廣泛存在于腸桿菌科細(xì)菌中;其序列在腸桿菌科細(xì)菌中相對保守，在細(xì)菌多重耐藥中起重要作用。MarRAB操縱子包括:啟動子MarO、阻遏基因MarR及陽性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子MarA、MarB。MarR是Mar操縱子轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白，以同二聚體形式與MarO結(jié)合，負(fù)性調(diào)節(jié)MarRAB的轉(zhuǎn)錄; MarA是一種轉(zhuǎn)錄激活蛋白，與MarRAB操縱子上游區(qū)MarO中的Marbox結(jié)合，不僅調(diào)節(jié)自身轉(zhuǎn)錄，也調(diào)節(jié)Mar調(diào)節(jié)子的表達(dá);目前MarB的功能未知。Vinué等［8］研究結(jié)果表明由216 bp基因編碼的MarB作為胞質(zhì)周質(zhì)蛋白，可能作為一種參與細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的信號，抑制Mar-RAB啟動子。MarRAB的轉(zhuǎn)錄亦可由MarA的同系物SoxS和Rob激活。在氟喹諾酮耐藥的大腸桿菌中，MarR抑制子的突變導(dǎo)致MarRAB操縱子的組成型表達(dá)［9］; MarR抑制子暴露于水楊酸鹽也可以減低RarR的抑制作用，提高M(jìn)arA的表達(dá)。研究認(rèn)為MarOR基因第1 376～1 379處的4個堿基缺失，可使志賀菌對部分抗生素的耐藥性增加［10］。

2.2.2SoxS和Rob SoxS屬于AraC/XylS家族成員之一，是SoxRS超氧化反應(yīng)調(diào)節(jié)子的效應(yīng)基因，受SoxR正向調(diào)節(jié)。SoxR是一種組成型表達(dá)的同二聚體轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，它包括具有氧化還原活性的鐵-硫簇;這些鐵-硫簇的氧化反應(yīng)激活SoxR，從而觸發(fā)了SoxS基因的轉(zhuǎn)錄。在大腸桿菌及沙門菌臨床株和實驗株中，SoxRS調(diào)節(jié)子的激活有助于提高菌株對喹諾酮、奈叮酸和氯霉素的耐藥性。SoxS的組成型表達(dá)源于SoxR C末端的突變。在體外誘導(dǎo)耐藥的大腸桿菌突變株中發(fā)現(xiàn)SoxR第125位天冬酰胺被賴氨酸代替，這個位點(diǎn)臨近包括4個半胱氨酸的C末端簇，導(dǎo)致SoxS的過表達(dá)。Zheng等［11］研究結(jié)果表明，在氟喹諾酮耐藥的鼠傷寒沙門菌LTH中，SoxR基因出現(xiàn)3個堿基替代(T313、C317、C321)，產(chǎn)生了兩個氨基酸殘基的改變，導(dǎo)致SoxS的過表達(dá)并參與了細(xì)菌對氟喹諾酮的耐藥性。O' Regan等［12］也發(fā)現(xiàn)SoxR的突變(第20位精氨酸變?yōu)榻M氨酸)提高了SoxS的表達(dá)并有助于沙門菌產(chǎn)生多重耐藥性。Fàbrega等［13］發(fā)現(xiàn)，在諾氟沙星體外誘導(dǎo)耐藥的大腸埃希菌突變株NorE5中，SoxS和MarA的表達(dá)水平明顯提高;對SoxRS的測序發(fā)現(xiàn)在402位插入兩個腺嘌呤，在134位賴氨酸處插入1個讀碼框，在7個密碼子后產(chǎn)生了終止子，使得C末端的氨基酸缺失;此外該研究也提示MdtG基因是MarASoxS-Rob調(diào)控系統(tǒng)中的一部分，其產(chǎn)物MdtG過度表達(dá)能夠?qū)е履退幮栽黾?，MdtG的marbox破壞后，MarA、SoxS、Rob的誘導(dǎo)能力均下降。相關(guān)研究表明，SoxR 136～144位氨基酸的缺失(影響最后19個氨基酸)也可導(dǎo)致SoxS的組成型表達(dá)。Kehrenberg等［14］在沙門菌中發(fā)現(xiàn)SoxR基因內(nèi)49個堿基插入?yún)⑴cSoxS上調(diào)及提高了外排活性。在大腸桿菌中，Rob的過表達(dá)通過激活A(yù)crB而賦予細(xì)菌多重耐藥表型。

2.2.3RamA除了MarA/SoxS/Rob家族，George等［15］發(fā)現(xiàn)并證實了RamA作為AraC/XylS家族的另一成員，對克雷伯菌的多重耐藥性起到重要作用。最近相繼在陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌及沙門菌中發(fā)現(xiàn)RamA基因; RamA結(jié)合位點(diǎn)位于AcrAB基因上游，是沙門菌外排泵AcrAB-TolC的主要調(diào)節(jié)因子，其主要作用是促進(jìn)AcrAB基因的表達(dá)，有助于細(xì)菌對氟喹諾酮及多重耐藥性的產(chǎn)生［16］。RamR位于RamA基因上游，作為RamA的抑制子調(diào)節(jié)RamA基因的表達(dá)。RamR的結(jié)合位點(diǎn)覆蓋RamA啟動子的主要特征，包括-10保守區(qū)、RamA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和2個長7 bp的翻轉(zhuǎn)重復(fù)序列。RamR及RamRRamA區(qū)的基因突變在RamA和AcrAB的上調(diào)中起重要作用，從而賦予泵介導(dǎo)的多重耐藥表型。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，RamR區(qū)6個氨基酸(T18P、R46N、R46P、Y59H、M84I和E160D)的替代同細(xì)菌的多重耐藥性相關(guān)［14，16，17］。在鼠傷寒沙門菌中，由RamR點(diǎn)突變所致氨基酸的替代或框移位、RamA啟動子的缺失以及由于IS1啟動子的插入導(dǎo)致RamR的失活均導(dǎo)致了外排泵基因表達(dá)水平的提高及多重耐藥性的產(chǎn)生。Abouzeed等［16］報道在鼠傷寒沙門菌DT104中，RamA上游2個堿基對的缺失在RamA和AcrAB的上調(diào)中起重要作用;而Zheng等［18］的研究表明在氟喹諾酮耐藥的沙門菌中，RamA啟動子區(qū)9個堿基的缺失，其中也包括Abouzed報道的2個堿基的缺失，推測可能是RamR的結(jié)合位點(diǎn)，激活了RamA。Kehrenberg等［14］發(fā)現(xiàn)在沙門菌中RamR-RamA區(qū)不同位置的突變及SoxR基因的突變均可導(dǎo)致AcrAB外排泵的上調(diào)，包括點(diǎn)突變、RamR基因10～15個堿基缺失以及RamR結(jié)合位點(diǎn)的單個堿基的替代。Zheng等［18］的研究結(jié)果表明，組成型RamA轉(zhuǎn)錄水平的提高可以導(dǎo)致細(xì)菌多重耐藥表型，在菌株LTL中，最低抑菌濃度水平的提高伴隨AcrAB和RamA的組成型過表達(dá);而已知的調(diào)節(jié)子如MarA和SoxS的表達(dá)水平?jīng)]有變化，表明RamA是AcrAB表達(dá)的激活子。

綜上所述，外排泵AcrAB-TolC對腸桿菌科細(xì)菌多重耐藥性起重要作用，而其復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步研究和探索，為新型抗菌藥物或外排泵抑制劑的研究提供重要的靶作用位點(diǎn);此外，通過對外排泵AcrAB-TolC結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制的深入研究，為細(xì)菌其他外排系統(tǒng)的研究提供思路。

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(收稿日期:2015-01-06)

通信作者:程玉謙

基金項目:天津醫(yī)科大學(xué)科學(xué)基金資助項目(2010KY47)。

文章編號:1002-266X(2015)21-0095-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R378.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.039