劉沖，隋華，朱惠蓉，李冬，李琦(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院，上海00065;上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院)

miR-200c基因重組慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建及其人結(jié)腸癌多藥耐藥動物模型的建立

劉沖1，隋華2，朱惠蓉2，李冬1，李琦2
(1同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院，上海200065;2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院)

摘要:目的構(gòu)建共同表達(dá)人miR-200c基因和熒光素酶基因的慢病毒(Lentivious)表達(dá)載體質(zhì)粒，實現(xiàn)該重組體在人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞中的穩(wěn)定整合以及動物模型的建立，為進(jìn)一步研究miR-200c調(diào)控大腸癌多藥耐藥提供實驗基礎(chǔ)。方法將miR-200c基因克隆至慢病毒pGC-Lentivirus表達(dá)載體中，測序鑒定后，包裝重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行滴度測試。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將攜帶miR-200c過表達(dá)的慢病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-116/L-OHP中，并接種于裸鼠皮下，以空病毒載體作為對照。待腫瘤生長2周后，隨機(jī)分為4組，分別給予生理鹽水和奧沙利鉑(L-OHP)，4周后處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤，測量腫瘤體積。結(jié)果病毒滴度測試最佳滴度為2×108TU/mL。qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-200c-Lentivirus病毒質(zhì)粒的人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞中miR-200c表達(dá)高于轉(zhuǎn)染空載體組以及空白對照組，P均＜0.01。活體成像觀察證實，帶有熒光素酶的HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc細(xì)胞在動物體內(nèi)可被快速而靈敏的檢測到，可以準(zhǔn)確地觀察腫瘤的生長情況。與HCT-116/L-OHP-luc組相比，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc組對L-OHP的敏感性更強(qiáng)，P＜0.05。結(jié)論成功構(gòu)建攜帶人miR-200c基因慢病毒載體質(zhì)粒，實現(xiàn)重組體在人結(jié)腸癌HCT-116/L-OHP多藥耐藥細(xì)胞中的穩(wěn)定整合，并建立了帶有熒光素酶miR-200c過表達(dá)的人結(jié)腸癌多藥耐藥動物模型。

關(guān)鍵詞:結(jié)腸癌;多藥耐藥;微小核糖核酸;慢病毒載體;動物模型;活體成像

大腸癌多藥耐藥耐藥的發(fā)生和發(fā)展是一個涉及多基因、多階段、多因素異常積累且相互作用的復(fù)雜過程［1，2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在細(xì)胞增殖、分化、腫瘤的血管形成和轉(zhuǎn)移等方面起著重要的作用［3～5］。有研究表明，miR-200c的下調(diào)參與腫瘤多藥耐藥的發(fā)生、發(fā)展［6］，但是具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確。2013年10月～2014年10月進(jìn)行本研究，在構(gòu)建攜帶miR-200c基因慢病毒載體質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，將其轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑(L-OHP)多藥耐藥細(xì)胞株HCT-116/L-OHP，篩選穩(wěn)定表達(dá)miR-200c的HCT-116/L-OHP，并建立人結(jié)腸癌多藥耐藥的動物模型，為臨床多藥耐藥研究奠定實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料擴(kuò)增miR-200c材料為上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供克隆模板; GV209靶點篩選系統(tǒng)慢病毒表達(dá)載體及包裝質(zhì)粒(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司) ; Taq DNA聚合酶、4×dNTP(Takara公司) ; DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Age I和EcoR I(NEB公司) ; RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒(QIAGEN公司) ; Lipofecter2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(碧云天公司) ; Marker、低熔點瓊脂糖(上海生物工程公司)。Babl/c/nu裸鼠，雄性，體質(zhì)量(18±2) g，SPF級，購自中科院上海實驗動物中心，合格證編號: SCHK(新) 2008-0016。實驗前在實驗室常規(guī)飼養(yǎng)1周。293T細(xì)胞株、HCT-116/LOHP及其親本株HCT-116，由上海中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合腫瘤介入研究所保存。

1.2方法

1.2.1慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定將慢病毒pHelper-GV209進(jìn)行Age I酶切，線性化處理; 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段，并回收條帶。將miR-200c基因PCR產(chǎn)物交換進(jìn)入線性化慢病毒載體，加入的線性化載體DNA和純化的PCR產(chǎn)物的摩爾數(shù)比例為1∶3～1∶9，設(shè)置陽性對照和自連對照。將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α，長出克隆后進(jìn)行PCR鑒定，鑒定陽性結(jié)果進(jìn)行測序。

1.2.2重組慢病毒包裝取對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，按照每孔1.2×106個細(xì)胞接種。轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，待細(xì)胞70%融合時分別將慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒與pGC-GFP/Lentivirus質(zhì)粒混勻，加入250 μL opti-MEM去血清培養(yǎng)液中，并用Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染于相應(yīng)的293T細(xì)胞組中。轉(zhuǎn)染后48 h后可置于熒光顯微鏡下觀察兩組細(xì)GFP的表達(dá)情況，確定包裝成功。72 h收集上清，3 000 r/min離心20 min，并經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，將病毒上清于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3病毒滴度測定孔稀釋法測定病毒滴度。將病毒儲存液按梯度稀釋至10－4，依次取10 μL加到細(xì)胞中，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)液，3～4 d后觀察熒光表達(dá)。正常情況下，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相應(yīng)減少，計數(shù)最大稀釋倍數(shù)孔中的帶有熒光的細(xì)胞個數(shù)。病毒滴度(TU/mL)=(熒光細(xì)胞個數(shù)×轉(zhuǎn)染時細(xì)胞數(shù)/100×每孔加入病毒稀釋液體積)×1/稀釋濃度。

1.2.4重組慢病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞將人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞分為2組:陰性重組慢病毒組對HCT-116/L-OHP進(jìn)行陰性慢病毒Vector-Lentivirus轉(zhuǎn)染; miR-200c重組慢病毒組對HCT-116/L-OHP結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-200c過表達(dá)重組慢病毒miR-200c-Lentivirus。轉(zhuǎn)染前2 d以胰酶消化HCT-116/LOHP細(xì)胞，接種于24孔板，每孔計數(shù)(1～3)×105個細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長至50%的培養(yǎng)基面積時用于轉(zhuǎn)染。將病毒原液稀釋1×106溶于5 mL培養(yǎng)基，100 μL Lipofeetamine2000溶于5 mL培養(yǎng)基?；旌虾?0 min，緩慢加入HCT-116/L-OHP細(xì)胞中。24 h后將培養(yǎng)液換為含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。感染48 h后，將培養(yǎng)板中的細(xì)胞按梯度稀釋法比例接種，挑取克隆及擴(kuò)增培養(yǎng)，并加入2 μg/mL的嘌呤霉素篩選，每隔3～5 d換液1次。當(dāng)非熒光細(xì)胞幾乎被完全殺死時，降低嘌呤霉素濃度，采用維持濃度(2 μg/mL)維持細(xì)胞的篩選。10 d后可見培養(yǎng)板底有細(xì)胞克隆形成，并作好標(biāo)記。將標(biāo)記好的陽性克隆用100 μL槍頭進(jìn)行挑取，移至仍為維持濃度的嘌呤霉素的完全培養(yǎng)液的24孔板中，繼續(xù)擴(kuò)增，消化、傳代培養(yǎng)，凍存。建立HCT-116/L-OHP-luc細(xì)胞和HCT-116/LOHP-miR-200c-luc細(xì)胞兩個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。

1.2.5miR-200c mRNA檢測方法采用實時熒光定量PCR法檢測目的基因miR-200c mRNA表達(dá)。設(shè)計內(nèi)參基因U6和目的基因miR-200c的引物和探針。miR-200c:上游引物為5'- ACACTCCAGCT-GGGTAATACTGCCGGGTAAT-3'，下游引物為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCCATCAT-3'; U6:上游引物為5'-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATAT-3'，下游引物為5'-AAAAATATGGAACGCTTCACGAA-3'。用RNAiso試劑分別提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)成cDNA，按實時熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(20 μL) : Premix EX TaqTM 10 μL，Rox Reference Dye 0.4 μL，上、下游引物各0.4 μL，熒光探針0.8 μL，dH2O 6 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，72℃退火10 min，共30個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用ABI 7300 SDS Software分析。相對mRNA表達(dá)=2－ΔCt，ΔCt值=靶基因Ct值－GAPDH Ct值。

1.2.6裸鼠皮下移植瘤模型的建立方法取對數(shù)生長期的HCT-116/L-OHP、HCT-116/L-OHP-luc以及HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc細(xì)胞，以5×106/只數(shù)量接種于裸鼠腋下，每組接種6只。藥物采用臨床一線化療常用藥L-OHP，根據(jù)前期實驗用藥劑量經(jīng)驗。本實驗采用5 mg/kg，0.2 mL/只，隔日1次。模型評價實驗分為3組: HCT-116/L-OHP組、HCT-116/L-OHP-luc組和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc組。耐藥實驗分為4組: HCT-116/L-OHP-luc+生理鹽水(NS)組、HCT-116/L-OHP-luc+ LOHP(5 mg/kg)組、HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ NS組和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ L-OHP(5 mg/kg)組，連續(xù)給藥35 d。以頸椎脫臼法處死，剝離腫瘤組織，稱重;并用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長、寬度，計算瘤體體積。

1.2.7實驗動物活體成像的檢測采用美國精諾真活體成像系統(tǒng)(IVIS 200)觀測皮下腫瘤細(xì)胞的生長情況。觀測前記錄每只裸鼠體質(zhì)量，根據(jù)熒光素底物注射濃度(150 mg/kg裸鼠體質(zhì)量)，腹腔注射150 μL(30 mg/mL)熒光素底物，注射后10～25 min進(jìn)行活體成像，IVIS 200曝光時間為5～10 s。每周1次，持續(xù)60 d。

1.2.8統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以珋x±s表示，獨立樣本采用t檢驗，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1重組慢病毒載體質(zhì)粒滴度測定在本次滴度檢測中，10－4μL樣品中Ct值最高(ΔCt=18.695)，認(rèn)為在10－4μL樣品中存在病毒顆粒。假定該組樣品含有至少有1個病毒顆粒，根據(jù)病毒滴度計算公式，則病毒的滴度為2×108TU/mL。

2.2miR-200c mRNA相對表達(dá)經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-200c-Lentivirus后，HCT-116/L-OHP細(xì)胞miR-200c mRNA相對表達(dá)量為13.12±1.41，空白對照組和轉(zhuǎn)染空載體組分別為0.99±0.11和1.02±0.13; HCT-116/L-OHP細(xì)胞高于空白對照組和轉(zhuǎn)染空載體組，P均＜0.01。

2.3裸鼠皮下移植瘤模型的建立及活體成像結(jié)果HCT-116/L-OHP細(xì)胞株接種后腫瘤體積隨時間增加而增大，在觀察期內(nèi)無熒光素酶活性;而構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株HCT-116/L-OHP-luc和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc在接種10 d后均有熒光素酶表達(dá)，隨著接種天數(shù)的增加，熒光值逐漸增加，在第60天就已達(dá)到飽和。之后，腫瘤中心已出現(xiàn)壞死，中心熒光值降低，且HCT-116/L-OHP-luc組和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc組熒光值基本維持一致。見圖1。

2.4各組瘤體大小比較給藥35 d后，HCT-116/L-OHP-luc+ NS組、HCT-116/L-OHP-luc+ L-OHP組、HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ NS組和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ L-OHP組腫瘤體積分別為(998±90)、(500±80)、(980±80)、(300±30) mm3，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ L-OHP組小于HCT-116/L-OHP-luc+ L-OHP組，且均小于HCT-116/L-OHP-luc+ NS組和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ NS組，P均＜0.05。

3　討論

腫瘤多藥耐藥是一種獨特的廣譜耐藥現(xiàn)象，即一旦腫瘤細(xì)胞對一種化療藥產(chǎn)生耐藥后，同時也對結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制不同的其他藥物產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象［7～9］。miRNA是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子RNA，長度為22～28個核苷酸，廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)，是最大的基因家族之一，占整個基因組的1%～4%［10］。其主要作用機(jī)制是與靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)特異性的堿基互補配對，結(jié)合到靶基因mRNA上，抑制靶基因mRNA翻譯或直接使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)［11］。最新研究發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞中miR-200c參與了腫瘤耐藥的發(fā)生［6，12］，但是具體機(jī)制尚不明確。

與傳統(tǒng)的腫瘤動物模型相比，攜帶生物發(fā)光標(biāo)記的基因動物模型，可以在活體內(nèi)監(jiān)測腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移、基因的表達(dá)、機(jī)體的生理病理改變過程以及進(jìn)行藥物的篩選。這種可視化模型堪稱是動物模型檢測監(jiān)控領(lǐng)域的革命性進(jìn)步。因此，國內(nèi)外不少研究［13，14］已經(jīng)采用GFP或者紅色熒光蛋白這種特異性標(biāo)記物來標(biāo)記某種基因，再將該基因植入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，使腫瘤細(xì)胞成為發(fā)光源;然后接種動物體內(nèi)，通過活體成像的方式及時監(jiān)測活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動和基因行為。但是，對于攜帶miRNA基因特異性標(biāo)記物這方面的動物模型目前還未見文獻(xiàn)報道。本研究通過構(gòu)建miR-200c-GFP-Lentivirus以及對照慢病毒載體質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染到人結(jié)腸癌HCT-116/LOHP細(xì)胞，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-200c的HCT-116/L-OHP-GFP-Lentiviru細(xì)胞株。將攜帶miR-200c的HCT-116/L-OHP細(xì)胞接種于裸鼠皮下，成功建立了miR-200c過表達(dá)結(jié)腸癌耐藥腫瘤模型，通過活體成像觀察腫瘤的生長情況，達(dá)到更直觀地評價藥物對腫瘤的治療作用。

我們的研究顯示，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株表現(xiàn)出和野生型HCT-116/L-OHP細(xì)胞以及HCT-116/L-OHP-luc穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株相似的體外生長和體內(nèi)轉(zhuǎn)移特性，提示它們的結(jié)腸癌耐藥的生物學(xué)特性未受影響。通過活體成像熒光表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在瘤體增殖的同時，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc與HCT-116/L-OHP-luc的熒光值基本保持一致，說明熒光值與瘤體的大小是呈正相關(guān)［8］。該發(fā)現(xiàn)與大部分采用熒光載體觀測腫瘤的體內(nèi)模型的研究結(jié)果一致［15，16］。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在裸鼠皮下移植瘤HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc模型中，miR-200c具有較強(qiáng)的抗化療藥物作用，與L-OHP聯(lián)合使用，可有效抑制HCT-116/L-OHP結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)miR-200c的人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞系，利用該細(xì)胞株建立了裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型，證明miR-200c可有效地抑制腫瘤多藥耐藥的發(fā)生。通過分子和細(xì)胞水平進(jìn)行成像，直觀、活體、動態(tài)地連續(xù)觀察腫瘤的生長轉(zhuǎn)移情況，為腫瘤多藥耐藥的治療和藥物的篩選評價提供良好的技術(shù)平臺。

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Construction of miR-200c gene recombinant lentiviral vector and establishment of multi-drug resistance animal models in human colon cancer

LIU Chong1，SUI Hua，ZHU Hui-rong，LI Dong，LI Qi
(1 Tongji Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200065，China)

Abstract:Objective To construct the lentiviral vector co-expressing human miR-200c gene and luciferase，and establish a stable colorectal cancer multidrug resistance(MDR) cell model，in order to lay an experiment foundation for exploring the function of miR-200c in MDR.Methods miR-200c gene was cloned into the lentiviral vector(pGC-Lentivirus)，which was verified by PCR and sequencing analysis.After sequencing，we made lentiviral vector and titer test.Using cell transfection technique，miR-200c lentiviral vector was infected into MDR cell line HCT-116/L-OHP.A nude mouse model of colorectal MDR cancer was established by subcutaneous inoculation of this kind of cell; meanwhile，the empty vector was taken as the control group.Experimental nude mice were randomly divided into 4 groups after 2-week tumorgrowth.Mice in the control group were administered with normal saline daily.Mice in the experiment group were administered with oxaliplatin(L-OHP).After treatment for 4 weeks，mice in each group were sacrificed to measure tumor volume.Results The best titer was 2×108TU/mL.The qPCR showed that the levels of miR-200c mRNA expression in the resistant cells of human colon cancer which were transfected by miR-200c-Lentivirus were significantly higher than those in the empty vector group and the blank control group(all P＜0.01).In vivo imaging confirmed that HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc cells with luciferase could be tested quickly and sensitively，and could be used to watch the tumor growth.Compared with HCT-116/L-OHP-luc group，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc group showed more sensitive to L-OHP(P＜book=11,ebook=2450.05).Conclusion The lentiviral screening vector with human miR-200c gene is successfully constructed，which realizes the stable integration of the recombinant in the human colon cancer HCT-116/L-OHP MDR cells; meanwhile，its MDR colon cancer animal models which have miR-200c overexpression with luciferase are successfully constructed.

Key words:colonic carcinoma; multidrug resistance; miRNA; lentiviral vector; animal model; in vivo imaging

(收稿日期:2015-01-28)

通信作者簡介:李琦(1971-)，男，教授，曙光醫(yī)院腫瘤科主任，主要研究方向為中西醫(yī)結(jié)合腫瘤防治。E-mail: Lzwf@ hotmail.com

作者簡介:第一劉沖(1985-)，男，主管技師，主要研究方向為臨床檢驗診斷學(xué)。E-mail: lc2003lc2008@163.com

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(81202812，81373862，81403360) ;上海市科技委員會資助項目(13140902500) ;上海市衛(wèi)生局資助項目(2011ZJ030)。

文章編號:1002-266X(2015) 20-0010-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R735.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.004