張周建 張衛(wèi)兵 趙榮梅 沈明學(xué)

1（南通市衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇南通210008）2（南通市疾病預(yù)防控制中心，江蘇南通226007）

3（江蘇省寄生蟲病防治研究所，江蘇無(wú)錫214064）

動(dòng)物性水產(chǎn)品中寄生蟲檢驗(yàn)方法的研究與思考*

張周建1**張衛(wèi)兵2***趙榮梅1沈明學(xué)3

1（南通市衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇南通210008）2（南通市疾病預(yù)防控制中心，江蘇南通226007）

3（江蘇省寄生蟲病防治研究所，江蘇無(wú)錫214064）

我國(guó)食源性寄生蟲病病原種類繁多，存在于我國(guó)水產(chǎn)品中，對(duì)人類健康危害較大的寄生蟲主要有線蟲、吸蟲和絳蟲。水產(chǎn)品引起的食源性寄生蟲病屢見報(bào)道，如廣東省華支睪吸蟲病的人群感染率高達(dá)74.5%，曼氏裂頭蚴病在我國(guó)21個(gè)省、市、自治區(qū)已有800多例報(bào)告，以及2006年北京因食用福壽螺而引發(fā)的廣州管圓線蟲病疫情等。這些水產(chǎn)品引起的食源性寄生蟲病，與生食被寄生蟲感染的水產(chǎn)品有著密切關(guān)系，因此，在水產(chǎn)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)修訂以及江蘇省即食生食動(dòng)物性水產(chǎn)品地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂過(guò)程中，寄生蟲成為標(biāo)準(zhǔn)中的關(guān)鍵指標(biāo)之一，相應(yīng)的寄生蟲檢驗(yàn)方法也成為生食水產(chǎn)品安全標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容。

1 標(biāo)準(zhǔn)中寄生蟲檢驗(yàn)方法的建立

1.1 檢驗(yàn)方法的比較

寄生蟲檢驗(yàn)技術(shù)分為三類：一是病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)，主要借助顯微鏡進(jìn)行寄生蟲形態(tài)學(xué)觀察并根據(jù)觀察形態(tài)特征做種屬鑒定；二是分子生物學(xué)技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)通過(guò)檢測(cè)寄生蟲基因片段鑒定寄生蟲種屬，對(duì)于檢測(cè)食品或環(huán)境樣品中的原蟲包囊或卵囊是可靠的檢測(cè)技術(shù)；三是免疫層析技術(shù)，是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種將免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合的快速免疫分析方法，該技術(shù)較多應(yīng)用于檢測(cè)食品中的有害微生物、藥物殘留物，但對(duì)食品寄生蟲的檢測(cè)還為數(shù)不多。

病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)單、成本低廉，是目前食源性寄生蟲檢驗(yàn)最常用的技術(shù)，其他2種檢測(cè)技術(shù)對(duì)樣品制備、儀器設(shè)備的要求比較嚴(yán)格，操作復(fù)雜、成本較高。

1.2 檢驗(yàn)方法的選擇

綜合比較寄生蟲檢驗(yàn)技術(shù)，考慮到食品安全標(biāo)準(zhǔn)的使用對(duì)象除了寄生蟲專業(yè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)外，還包括水產(chǎn)養(yǎng)殖戶、生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)單位，標(biāo)準(zhǔn)所提供的方法應(yīng)操作簡(jiǎn)單、易于判斷、便于實(shí)施。因此，病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)比較適合用于標(biāo)準(zhǔn)中檢驗(yàn)方法的建立，而相較于燈檢法等病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)，蛋白酶消化法能夠有效提高檢出效率，是水產(chǎn)品中使用較多的寄生蟲確證性檢測(cè)手段。因此，最終選擇了蛋白酶消化法作為與標(biāo)準(zhǔn)配套的寄生蟲檢驗(yàn)方法。

1.3 檢驗(yàn)方法的建立

蛋白酶消化法是利用蛋白酶對(duì)魚肉進(jìn)行消化，而蟲體或囊蚴本身由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，不易被同步消化掉，從而分離出來(lái)進(jìn)行鑒別。方法的主要內(nèi)容包括消化液配置、儀器設(shè)備和樣品制備等。項(xiàng)目組結(jié)合實(shí)際應(yīng)用以及標(biāo)準(zhǔn)中寄生蟲指標(biāo)設(shè)置，建立了寄生蟲檢驗(yàn)方法，主要操作步驟如下。

第一步，人工消化液配置。取胃蛋白酶（粗制）5 g，溶解于900 mL蒸餾水中，加濃鹽酸7 mL，再加水至1 000 mL，充分混勻，放置15 min后備用。

第二步，試樣的制備。取適量肌肉用組織搗碎機(jī)打漿（低速，檢材粉碎即止），置三角燒瓶中以1∶10加入人工消化液，充分?jǐn)嚢?，并?7℃水浴箱中放置4h～5h使肌肉充分消化，用吸管吸去上清液，再加適量蒸餾水，攪拌后沉淀20 min～30 min，再吸去上清液，反復(fù)清洗幾次，直至上清液透明為止，沉淀備用。

第三步，樣品檢驗(yàn)。取經(jīng)處理的沉淀物，在顯微鏡下，邊用蒸餾水稀釋邊觀察寄生蟲。另外，異尖線蟲幼蟲、闊節(jié)裂頭絳蟲、裂頭蚴等體積較大的蟲種，可撕開肌肉、內(nèi)臟后，用肉眼直接檢查，必要時(shí)通過(guò)顯微鏡檢查鑒定。

方法中所用的主要儀器設(shè)備有顯微鏡（倍數(shù)：10×10）、水浴箱或恒溫箱（37℃）、組織搗碎機(jī)。

1.4檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證

為驗(yàn)證上述方法的操作性和準(zhǔn)確性，項(xiàng)目組采集了50份水產(chǎn)品樣品，在開展檢驗(yàn)的同時(shí)，委托江蘇省寄生蟲病防治研究所等專業(yè)機(jī)構(gòu)使用上述方法進(jìn)行了同步檢驗(yàn)，檢出帶蟲樣品34份，檢出率為68%，與項(xiàng)目組檢測(cè)結(jié)果相一致，其中，異尖線蟲幼蟲檢出率為80%，華支睪吸蟲囊蚴檢出率20%。這個(gè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的檢出率基本一致：浙江舟山的張均和等報(bào)道，以舟山漁場(chǎng)為主的東海魚類異尖線蟲幼蟲感染率較高，29種海魚中檢出21種（72.41%）；東海黃海30多種海捕魚、軟體動(dòng)物檢測(cè)帶異尖線蟲幼蟲率84%。

2 與國(guó)標(biāo)中寄生蟲檢驗(yàn)方法的比較

在我國(guó)現(xiàn)有水產(chǎn)衛(wèi)生安全標(biāo)準(zhǔn)中，GB 10136—2005腌制生食動(dòng)物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了寄生蟲指標(biāo)和檢驗(yàn)方法，標(biāo)準(zhǔn)中寄生蟲的檢驗(yàn)方法也是蛋白酶消化法，但本研究新建立的方法與GB 10136—2005相比存在一定差異。

新方法適用范圍比GB 10136—2005更廣。由于GB 10136—2005對(duì)水產(chǎn)品所含寄生蟲可能致人體發(fā)病的因素考慮不太充分，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定寄生蟲指標(biāo)為不得檢出寄生蟲囊蚴，所以檢驗(yàn)方法僅適用于寄生蟲囊蚴檢驗(yàn)。而水產(chǎn)食品安全新標(biāo)準(zhǔn)中，寄生蟲指標(biāo)則按不同蟲種和感染階段分別予以限定，指標(biāo)為“吸蟲囊蚴、線蟲幼蟲、絳蟲裂頭蚴不得檢出”，因而新建立的檢驗(yàn)方法不僅適用于吸蟲囊蚴，也適用于線蟲幼蟲、絳蟲裂頭蚴的檢驗(yàn)。

新方法增加了對(duì)體積較大蟲體的檢驗(yàn)方法。新制修訂的水產(chǎn)品食品安全標(biāo)準(zhǔn)中，包括了線蟲幼蟲、絳蟲裂頭蚴等較大蟲體的寄生蟲，所以新建立的檢驗(yàn)方法中也對(duì)應(yīng)增加了體積較大蟲體的檢驗(yàn)方法。

新方法中人工消化液的配置以1 000 mL為單位，加濃鹽酸7 mL，而GB 10136—2005中人工消化液的配置是以100 mL為單位，加濃鹽酸0.7 mL。在實(shí)際操作中，取7 mL的濃鹽酸相較于取0.7 mL的濃鹽酸更易操作，消化液配置的濃度也更精準(zhǔn)。

新方法試樣以1∶10加入人工消化液進(jìn)行制備，而GB 10136—2005中是以1∶1比例進(jìn)行制備。比例變化的主要是因?yàn)槿斯は簼舛鹊淖兓?，新方法人工消化液的濃度是GB 10136—2005設(shè)定的1/10，所以試樣制備時(shí)加入的人工消化液是GB 10136—2005的10倍。

新方法明確了儀器設(shè)備的參數(shù)，按照實(shí)際檢驗(yàn)要求，明確顯微鏡倍數(shù)為10×10，并將GB 10136—2005中的食品粉碎機(jī)改為組織搗碎機(jī)，更有利于檢驗(yàn)工作的開展。

3 討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)方法應(yīng)與指標(biāo)相配套

與微生物、污染物等指標(biāo)不同，水產(chǎn)品食品安全標(biāo)準(zhǔn)中寄生蟲指標(biāo)沒(méi)有獨(dú)立的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，因此，在制訂生食水產(chǎn)品安全標(biāo)準(zhǔn)時(shí)必須提供相配套的寄生蟲檢驗(yàn)方法，以滿足指標(biāo)檢驗(yàn)的需要。雖然GB 10136—2005中有寄生蟲檢驗(yàn)方法，但由于該方法規(guī)定僅適用于囊蚴的檢驗(yàn)，與生食水產(chǎn)食品安全標(biāo)準(zhǔn)中寄生蟲指標(biāo)不配套，所以沒(méi)有引用GB 10136—2005的檢驗(yàn)方法，而是重新建立了配套的檢驗(yàn)方法。

3.2 提高檢驗(yàn)技術(shù)人員的檢驗(yàn)水平

由于水產(chǎn)品中寄生蟲囊蚴和幼蟲較小，有些形態(tài)、大小也較接近，使用蛋白酶消化法時(shí)，對(duì)檢驗(yàn)技術(shù)人員的檢驗(yàn)水平、經(jīng)驗(yàn)提出了較高的要求，為了避免造成漏檢、誤檢，應(yīng)加強(qiáng)寄生蟲檢驗(yàn)技術(shù)、寄生蟲基礎(chǔ)知識(shí)的培訓(xùn)，不斷提高檢驗(yàn)技術(shù)人員的技術(shù)熟練程度和鑒別能力。

3.3 加強(qiáng)生食水產(chǎn)品寄生蟲風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)

食源性寄生蟲病已成為影響我國(guó)食品安全和人民健康的重要因素之一，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)食源性寄生蟲病的監(jiān)測(cè)。項(xiàng)目組制定的生食水產(chǎn)品安全標(biāo)準(zhǔn)不僅設(shè)置了寄生蟲指標(biāo)，而且建立了配套的寄生蟲檢驗(yàn)方法，為生食水產(chǎn)品中寄生蟲的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)依據(jù)。生食水產(chǎn)品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)單位應(yīng)建立寄生蟲檢驗(yàn)制度，通過(guò)感官檢驗(yàn)對(duì)供應(yīng)的生食水產(chǎn)品進(jìn)行寄生蟲篩檢。食品安全監(jiān)管部門應(yīng)將寄生蟲指標(biāo)納入風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)范疇，開展生食水產(chǎn)品中寄生蟲的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，及時(shí)分析、評(píng)估監(jiān)測(cè)結(jié)果，對(duì)食源性寄生蟲病的暴發(fā)、流行做出預(yù)警。

3.4 研究制定寄生蟲檢驗(yàn)方法食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

目前，寄生蟲檢驗(yàn)技術(shù)較多，但食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)體系中尚無(wú)寄生蟲檢驗(yàn)方法，項(xiàng)目組認(rèn)為，在傳統(tǒng)病原生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)上，研究先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)或免疫層析技術(shù)在食源性寄生蟲檢驗(yàn)中的應(yīng)用，制定寄生蟲檢驗(yàn)方法的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，不僅可以完善食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)體系，更重要的是可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法存在的不足，提高食源性寄生蟲檢驗(yàn)的效率，增強(qiáng)預(yù)防食源性寄生蟲病的工作力度。

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Establish the parasite inspection methods of the food safety standard of raw animalaquatic*

ZHANGZhoujian1**ZHANGWeibing2***ZHAORongmei1SHENMingxue3

1（Nantongmunicipal institute ofhealth inspection，Jiangsu Nantong 210008，China）

2（Nantong centers for disease control and prevention，Jiangsu Nantong 226007，China）

3（Jiangsu research institute ofprevention and control parasitic diseases，Jiangsu Wuxi 214064，China）

寄生蟲是影響生食水產(chǎn)品食用安全的重要隱患之一。在水產(chǎn)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)修訂以及江蘇省即食生食動(dòng)物性水產(chǎn)品地方標(biāo)準(zhǔn)制訂過(guò)程中，為了形成與標(biāo)準(zhǔn)中涉及寄生蟲指標(biāo)相匹配的檢驗(yàn)方法，開展了水產(chǎn)品中寄生蟲檢驗(yàn)方法的探索與研究，并通過(guò)驗(yàn)證確證，建立了相應(yīng)的檢驗(yàn)方法。

動(dòng)物性水產(chǎn)品；寄生蟲；檢驗(yàn)方法

Parasites are one of the important hidden trouble of raw edible safety ofaquatic products.In aquatic national food safety standards revision and jiangsu ready-to-use raw animal aquatic products in the process of local standards,in order tomatch the indicatorsinvolved in the formation and standard parasitesofinspectionmethods,carryouttheparasites in the testingmethod ofexploration and research ofaquatic products,and the verification is confirmed,through which the corresponding inspectionmethodswereestablished.

animal aquatic products；parasites；inspection methods

TS254.7

A

1673-6044（2015）04-0045-03

10.3969/j.issn.1673-6044.2015.04.013

南通市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)青年科研基金項(xiàng)目（WQ2014071）。

**張周建，男，1981年出生，2012年畢業(yè)于南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生專業(yè)，碩士，助理研究員。

***張衛(wèi)兵，通訊作者：E-mail:ntzwb71@163.com.

2015-09-14