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毛細管電泳技術在氨基酸分析中的應用進展

2015-04-05 21:34:36李紅霞曹富媛
食品與生物技術學報 2015年1期
關鍵詞:緩沖溶液檢測法毛細管

李紅霞, 曹富媛, 常 輝

(1.河北聯(lián)合大學 化學工程學院,河北 唐山 063009;2.唐山市曹妃甸區(qū)質量技術監(jiān)督檢驗所,河北 唐山063299)

毛細管電泳技術在氨基酸分析中的應用進展

李紅霞1, 曹富媛1, 常 輝2

(1.河北聯(lián)合大學 化學工程學院,河北 唐山 063009;2.唐山市曹妃甸區(qū)質量技術監(jiān)督檢驗所,河北 唐山063299)

食品和生物體內氨基酸種類和含量對于人體健康至關重要。毛細管電泳儀以其成本低、污染小、高效和操作簡易等優(yōu)點被廣泛應用于氨基酸的分析中??偨Y了毛細管電泳儀結合紫外、質譜、熒光和電化學等檢測器用于氨基酸分析的最新應用進展,綜述了毛細管電泳法在氨基酸手性分離方面的應用。

氨基酸;毛細管電泳;檢測器;手性分離

氨基酸是生物體的重要組成單元,參與并控制著體內代謝,對一切生物體的生長發(fā)育有舉足輕重的作用,因此,氨基酸的檢測對于營養(yǎng)食品的研究與對機體營養(yǎng)狀況的判斷有著重要意義。分光光度法[1]、液相色譜法[2]、氣相色譜法[3]和氨基酸分析儀方法[4]等都可應用于氨基酸的檢測中,但是上述方法均存在各自局限性,如檢測靈敏度低、操作繁瑣、操作費用高等,在一定程度上限制了其在氨基酸檢測中的應用。

毛細管電泳法(capillary electrophoresis,CE)是20世紀80年代發(fā)展起來的一種以電場為推動力的高效分離技術,該方法具有成本低、污染小、高效和操作簡單等優(yōu)點。因此,毛細管電泳法用于氨基酸分析成為研究的熱點課題,主要應用于食品安全、生物科技、醫(yī)療診斷等領域。作者綜述了結合不同類型檢測器的毛細管電泳在氨基酸分析中的應用,介紹了近幾年該技術在氨基酸手性分離中的應用。

1 毛細管電泳技術

毛細管電泳儀將樣品中氨基酸分離后,結合不同的檢測器對每種氨基酸進行定性和定量分析。常用的檢測器有紫外檢測器(ultraviolet detector,UV)、激光誘導熒光檢測器 (laser-induced fluorescence,LIF)、質譜檢測器(mass spectrometric detection,MS)和電化學檢測器(electrochemical detection,EC)。

1.1 毛細管電泳-紫外檢測法(CE-UV)

CE-UV是根據(jù)氨基酸具有的紫外吸收性質對其進行定性定量分析的。由于某些氨基酸本身對紫外吸收較弱[5],因此,為了提高分析靈敏度,需要在樣品溶液中加入背景電解質(緩沖溶液)和衍生劑。因此,毛細管電泳紫外氨基酸分析方法包括直接紫外檢測法和衍生化紫外檢測法。

1.1.1 直接紫外檢測法直接紫外檢測法需要在樣品溶液中加入緩沖溶液,使樣品溶液形成穩(wěn)定的電滲流體系。據(jù)研究[6],毛細管柱內表面粒子運動方向及穩(wěn)定性和待分離氨基酸的運動方向和穩(wěn)定性均會受到pH值影響,因此,通過控制緩沖溶液的pH可以實現(xiàn)不同樣品中氨基酸的較好分離效果,常用的緩沖溶液體系是磷酸鹽和硼砂。Chen[7]選擇了水楊酸、苯甲酸和鄰苯二甲酸三種芳香羧酸分別對植物組織提取液中的氨基酸進行了分離,對比實驗中緩沖溶液分別選擇 10 mmol/L苯甲酸和 1 mmol/L陽離子表面活性劑正十四醇三甲基溴化銨(MTAB),在pH為10.2時可以達到最佳的分離效果,17種氨基酸均能被檢測。Zunic[8]對血液中未衍生的氨基酸和多肽進行了分離檢測,選擇的緩沖溶液為10 mmol/L磷酸氫二鈉、8 mmol/L P-氨基水楊酸和碳酸鈉(pH 10.2),并應用了析因實驗設計方法考察了電壓、pH和電解質濃度等因素對氨基酸分離效果的影響。Jiang[9]依據(jù)此原理對人體唾液和綠茶中的氨基酸進行了分析檢測,緩沖溶液中加入了體積分數(shù)0.05%HAc,pH為4.5。為了優(yōu)化實驗,Cédric[10]對毛細管的規(guī)格和背景電解質組成做了正交試驗,實驗發(fā)現(xiàn)內徑越小分離效率越高,但是負荷量較低,所以可以通過延長毛細管柱長來提高效率。

1.1.2 衍生化紫外檢測法衍生化紫外檢測法原理是在溶液中加入發(fā)色團以增強氨基酸對紫外的吸收,因此提高了紫外檢測器對氨基酸檢測的靈敏性。對衍生劑的選擇原則是選擇產(chǎn)生副產(chǎn)物最少,有選擇性的衍生劑。常用的衍生劑有鄰苯二甲醛(OPA)[11]、氯甲酸-9-芴基甲酯(FMOC-Cl)[12]、異硫氰酸熒光素(FITC)[13]和萘-2,3-二甲醛(NDA)[14]等。

1.2 毛細管電泳-質譜檢測法(CE-MS)

CE-MS是通過測定各峰的組分碎片離子質荷比對樣品中氨基酸實現(xiàn)定性和定量分析的。此技術對樣品定量分析靈敏度和準確性高,干擾少。

樊靜[15]應用CE-MS技術,結合主成分分析,對胃癌患者的尿液中氨基酸進行了分析,檢測結果能較準確地反映尿液中氨基酸變化,從而反饋被化驗者健康信息。Laura[16]采用此法,通過檢測6種非蛋白氨基酸(β-丙氨酸、氨基丁酸、L-焦谷氨酸、瓜氨酸、別異亮氨酸、鳥氨酸),對橄欖油摻假進行了分析。Tom[17]將此法應用于偵探工作,通過此方法分析了指紋殘留氨基酸,提高了破案的準確性。應用CE-MS技術,樣品溶液會在毛細管電泳和質譜儀接口處被稀釋。為了解決這一問題,在毛細管后裝入了電噴射離子裝置(CE-ESI-MS)。改進后,能使電泳分離的樣品不間斷打入質譜中,不僅避免了液體在接口處稀釋的問題,而且節(jié)省了分析時間,減少了裝置接口處的死體積。實驗證明[18]CE-ESI-MS比CE-MS花費小,且可以檢測更多種氨基酸。

Kawai[19]應用了此改進技術,成功的檢測了除草劑中的含磷氨基酸。Jeong[20]利用該技術,選擇了揮發(fā)性堿性電解質分析人體血清中氨基酸,電解質組成為乙酸銨、甲酸銨、碳酸氫銨和醋酸,緩沖溶液的pH值為10.8,檢測分析時間低于15 min。

1.3 毛細管電泳-熒光檢測法(CE-LIF)

CE-LIF要求被檢測氨基酸樣品有熒光吸收,因此要對樣品進行衍生化處理。CE-LIF對樣品檢測分析靈敏度極高,且進樣量少,因此,在疾病診斷、評估和監(jiān)測疾病對藥物治療方面應用較多。

CE-LIF對衍生劑、分離條件和檢測條件的選擇有較高要求。王宇飛[21]以4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑(NBD-F)為衍生劑,選擇的25 mmol/L硼砂、20 mmol/L聚氧乙烯月桂醚(Brij-35)和體積分數(shù)5%乙腈(pH 9.5)的緩沖體系,分析了谷胱甘肽鈉藥品中氨基酸含量,分析時間為11 min,檢測限可達為0.1 μg/mL。Lorenzo[22]應用此法,采用的衍生劑為NBD-F,衍生時間為35 min,檢測了人體血漿中氨基酸含量,從而判斷實驗者是否患有抑郁癥。

1.4 毛細管電泳-電化學檢測法(CE-EC)

CE-EC可直接檢測未衍生的氨基酸含量,有良好的選擇性,儀器造價低廉,多用于生理液等臨床樣品的分析檢測。實驗者往往通過修飾工作電極對CE-EC進行優(yōu)化,通常選用的工作電極有碳、銅、金和鉑等。工作電極選擇中應該考慮對檢測物質有一定響應值,但不易被液體污染,并且經(jīng)濟。

Lenka[23]應用CE-EC成功實現(xiàn)了對生理液的檢測,結合了液膜技術對氨基酸與其它非氨基酸物質(蛋白質、高濃度無機鹽)進行分離。為了避免短路,使用的是非接觸式的鉑電極。Dossi[24]把混合化合價的釕氧聚合物涂抹在玻璃碳電極上,提高了電極的響應靈敏度。董永平[25]用Ag2S/Cu2S納米晶修飾玻碳電極檢測了半胱氨酸,檢出限可達6.0×10-6mol/L。Tuma[26]選擇醋酸溶液為背景電解質,對臨床樣品中的氨基酸進行分離,同樣使用非接觸式電極對樣品檢測,分析時間低于6 min。研究發(fā)現(xiàn),CE-EC比任何一種檢測器分離分析技術都省時。

1.5 其他毛細管電泳技術

毛細管電泳技術在氨基酸檢測方面已日趨重要,成為了熱點研究課題。Fengbin[27]應用毛細管前沿技術(CE-FA)對β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)和β-萘酰胺衍生劑的結合力進行了研究,表明兩者由靜電結合力聚合在一起,應用此技術可以通過計算結合鍵力來判斷最佳衍生時間,為選擇最好的衍生條件提供了理論基礎。為了提高毛細管電泳對氨基酸的分析靈敏度,Jeongmi[28]結合了單滴微萃取技術(SDME)對人類尿液樣品進行分析,萃取劑為壬烷-1-磺酸,萃取時間20 min,把氨基酸濃度提高到了之前的120倍,檢測靈敏度明顯提高,此技術在臨床樣品分析中結合質譜檢測器可以達到更好的效果。據(jù)研究[29],緩沖溶液的pH值會影響離子淌度,控制緩沖溶液pH值對毛細管電泳分離效果很重要,Tak[30]通過監(jiān)測動態(tài)pH界面,隨時調整pH至最適宜值,優(yōu)化了毛細管分離方式。

2 毛細管電泳技術在手性氨基酸分離中的應用

由于L-和D-氨基酸(手性氨基酸)在生物體中有不同的代謝作用,在制藥方面也各有差異[31],因此,近幾年對手性氨基酸的分離檢測也成為研究熱點和難點。毛細管電泳技術以其微量、高效和省時等優(yōu)點廣泛應用在手性氨基酸的分離和檢測。對于手性氨基酸的分離是通過改變其旋光性而實現(xiàn)的,重點研究領域是藥物的制備和臨床樣品的分析。常用的手性分離劑有環(huán)糊精[32]、金屬配合物Cu(Ⅱ)[7]和Zn(Ⅱ)[33]、大環(huán)抗生素[34]和冠醚[35]。其中環(huán)糊精因其帶電性不同又分為中性環(huán)糊精[36]、負電性環(huán)糊精[37]、正電性環(huán)糊精[38]和兩性環(huán)糊精[39]。

Ioannis[40]單獨使用了手性分離劑聯(lián)萘酚磷酸酯(BNP)對氨基酸進行分離。目前,在研究中并不單一的使用手性分離劑,而是在樣品溶液中加入衍生劑和合適的背景電解質,使得手性劑優(yōu)先與氨基酸的功能基團發(fā)生化學反應,提高手性劑的化學選擇性。Fradi[41]選擇了β-環(huán)糊精為手性試劑,經(jīng)濟便宜的芴甲氧羰基(FMOC)為衍生劑,十二烷基硫酸鈉(SDS)和異丙醇和硼砂為背景電解質,對L-和D-氨基酸進行了分離,達到了預期效果。實驗表明SDS對手性劑的化學選擇性有很大幫助,因此,對于毛細管電泳手性分離技術,選擇合適的背景電解質、衍生劑和分離條件也是至關重要的,尤其當手性分離劑選擇環(huán)糊精時,溫度控制至關重要,一般高溫會減弱手性分離劑與氨基酸的結合鍵力。

3 展望

毛細管電泳技術的應用雖然不斷拓展發(fā)展,但是此技術在氨基酸分離檢測過程中還存在衍生劑的選擇和實驗條件的優(yōu)化等一系列問題亟待解決。為了精準分析臨床樣品、藥物和食品中的氨基酸需對這些問題進行更深入細致的研究。此外,還可以結合偏最小二乘法、主成分回歸法和其他數(shù)學方法對分析值進行統(tǒng)計預測,為全面對氨基酸定性定量分析做理論支撐。

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Review on Development and Applications in Amino Acids Analysis by Capillary Electrophoresis

LI Hongxia1, CAO Fuyuan1, CHANG Hui2
(1.Chemical Engineering College,Hebei United University,Tangshan 063009,China;2.Tangshan Caofeidian Quality and Technique Supervision and Inspection Institute,Tangshan 063299,China)

Analysis of amino acid in food and organisms is vital for people's health.Capillary electrophoresis characterized by low cost,less pollution,high efficiency and simple operation is widely used in analysis of amino acids.The developing and application of amino acids analysis by capillary electrophoresis combined with ultraviolet detector,mass spectrometry detector,fluorescence detector and electrochemical detector was reviewed.And capillary electrophoresis used in the chiral separation for amino acids was reviewed.

amino acid,capillary electrophoresis,detection,chiral separation

O 657.8

A

1673—1689(2015)01—0001—06

2014-05-16

河北省人力資源和社會保障廳項目(2012003);唐山市科技局項目(13130225z)。

李紅霞(1963—),女,內蒙古呼倫貝爾人,理學博士,教授,主要從事化學分離與分析研究。E-mail:lhx2453@126.com

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