陳芳　王麗輝　劉斌　張靜　王薇　孫素真

作者單位: 050031石家莊市，河北省兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

唑尼沙胺對癲癇大鼠腦組織NO含量的影響及相關(guān)性研究

陳芳王麗輝劉斌張靜王薇孫素真

作者單位: 050031石家莊市，河北省兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

【摘要】目的探討新型抗癲癇藥物唑尼沙胺的作用機(jī)制。方法將50只戊四氮致癇大鼠隨機(jī)抽取8只為正常對照組，余42只造模成功后，隨機(jī)抽取24只作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為唑尼沙胺組、苯巴比妥組和癲癇模型組，每組8只。監(jiān)測4組大鼠唑腦組織NO、MDA含量及NOS、SOD的活性變化并觀察大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果癲癇組大鼠腦組織NO、MDA含量及NOS活性與正常對照組比較明顯增高(P＜0.05)，SOD活性明顯降低(P＜0.05);唑尼沙胺組及苯巴比妥組大鼠腦組織的NO、MDA含量及NOS活性與癲癇組比較明顯降低(P＜0.05)，SOD活性明顯升高(P＜0.05);唑尼沙胺能夠改善癲癇大鼠海馬組織的結(jié)構(gòu)。結(jié)論唑尼沙胺通過降低腦組織NO含量而發(fā)揮其抗癲癇作用。

【關(guān)鍵詞】唑尼沙胺;戊四氮;癲癇;一氧化氮;海馬

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癲癇作為一種特殊的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，人們一直在探尋其治療方法。近年來，國內(nèi)外眾多學(xué)者對NO在癲癇的發(fā)病機(jī)制中起作用進(jìn)行研究，并證實(shí)其致癇性。為此，我們以戊四氮致癇大鼠作為研究對象，分析各組大鼠腦組織NO含量的變化，探索新型抗癲癇藥物唑尼沙胺的抗癲癇機(jī)制，為癲癇治療提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠50只，體重(250 ±20)g(許可證號(hào): 1310073河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。實(shí)驗(yàn)前先將所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)7 d，以適應(yīng)環(huán)境。從所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中隨機(jī)抽取8只為正常對照組，剩余42只全部腹腔注射戊四氮制成癲癇模型。在成功的癲癇模型中隨機(jī)抽取24只作為本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為唑尼沙胺組、苯巴比妥組和癲癇模型組，每組8只。

1.2方法

1.2.1模型制作:所有致癇大鼠均給予戊四氮溶液45 mg/kg，每24小時(shí)腹腔注射1次，注射后均觀察40 min，觀察、記錄致癇大鼠發(fā)作的潛伏期、驚厥發(fā)作的表現(xiàn)及持續(xù)時(shí)間。致癇大鼠的癲癇表現(xiàn)形式采用Racine分級評價(jià)標(biāo)準(zhǔn): 0級，無反應(yīng);Ⅰ級，濕狗樣抖動(dòng)和(或)面肌痙攣，如動(dòng)須、眨眼及節(jié)律性咀嚼;Ⅱ級，頸部肌肉的痙攣，出現(xiàn)點(diǎn)頭和(或)甩尾;Ⅲ級，單側(cè)前肢痙攣;Ⅳ級，雙側(cè)前肢痙攣，站立位出現(xiàn);Ⅴ級，全身強(qiáng)直、陣攣，失去平衡、跌倒。觀察實(shí)驗(yàn)大鼠在造模過程中出現(xiàn)以上分級中的Ⅳ～Ⅴ級表現(xiàn)，提示戊四氮點(diǎn)燃成功。正常對照組在同期給予同等容量的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。

1.2.2腦電圖監(jiān)測:從每組實(shí)驗(yàn)大鼠中抽取2只行腦電圖監(jiān)測:先用10%的水合氯醛35 mg/kg腹腔注射，麻醉大鼠后參照王凈凈等［1］方法固定于固定架上。再用頭皮針樣電極的單極導(dǎo)聯(lián)法［2］，連續(xù)描記2 min的腦電圖。腦電圖靈敏度20 μV/mm，時(shí)間常數(shù)為0.1 s。每次記錄前均在彩色顯示器上觀察信號(hào)，待信號(hào)基線平穩(wěn)后再將信號(hào)存入計(jì)算機(jī)硬盤。放置電極位置及導(dǎo)聯(lián):單極導(dǎo)聯(lián)法;取2根0.5寸針灸毫針為記錄電極分別刺入大鼠頭頂部中線兩側(cè)的頭皮下，再將導(dǎo)線連接到腦電圖的信號(hào)輸入設(shè)備，大鼠尾根部也需要電極的放置，接地。在每只大鼠的第6次癲癇發(fā)作時(shí)描記腦電圖，先觀察行為學(xué)變化，再記錄腦電圖變化。

1.2.3藥物劑量及途徑:造模成功后0.5 h，唑尼沙胺組給予唑尼沙胺45 mg·kg－1·d－1灌胃;苯巴比妥組給予苯巴比妥35 mg·kg－1·d－1灌胃;正常對照組、癲癇組給予同等體積的0.9%氯化鈉溶液。1次/d，于11∶00前給藥，連續(xù)給藥14 d。

1.2.4標(biāo)本的采集:所有動(dòng)物在試驗(yàn)2周時(shí)稱重后，首先將大鼠以戊巴比妥鈉40 mg·kg－1·d－1腹腔注射麻醉后，仰臥位固定在大鼠手術(shù)板上。斷頭取出整塊的腦組織。用吸水紙粘去多余水分，將腦組織稱重，取一側(cè)大腦半球經(jīng)甲醛固定后行病理切片觀察;另一側(cè)大腦用0.9%氯化鈉溶液按1 g∶9 ml比例制成10%的腦組織勻漿，取上清液，冰凍－70℃待測。

1.2.5標(biāo)本的測定:將腦組織上清液從冰箱取出后常溫融化后按照各試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行檢測;

1.2.6病理學(xué)觀察:將HE染色的海馬組織切片置于光鏡下觀察。每只動(dòng)物均取2張組織切片，每張切片均按由CA1、CA2、CA3、CA4的順序隨機(jī)觀察5個(gè)不重復(fù)視野，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬組織的神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)目分布。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，先行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的資料，方差齊性檢驗(yàn)后，多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，2組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1癲癇大鼠的特征共給42只SD大鼠注射戊四氮，其中有2只大鼠有Ⅴ級發(fā)作持續(xù)10 min以上而死亡，占戊四氮致癇大鼠的4.8%。所有大鼠均在第1次腹腔注射戊四氮后出現(xiàn)Ⅲ級及以上驚厥發(fā)作，表現(xiàn)為點(diǎn)頭、前肢痙攣性抽動(dòng)及點(diǎn)頭等癥狀。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，致癇大鼠的發(fā)作癥狀逐日加重。其中90%的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可在第2次注射戊四氮后，表現(xiàn)出雙側(cè)前肢抬起和(或)陣攣性抽動(dòng)，甚至直立位;提示致癇大鼠的發(fā)作級別已經(jīng)達(dá)到RacineⅣ級及以上。第3次戊四氮腹腔注射后，5只未達(dá)RacineⅣ級發(fā)作。最終35只大鼠點(diǎn)燃成功，占所有致癇大鼠的83%。正常對照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液14 d，無癲癇發(fā)作;癲癇模型組腹腔注射每日腹腔注射戊四氮維持癲癇發(fā)作。其癲癇發(fā)作在戊四氮腹腔注射3～5 min開始出現(xiàn)，首先表現(xiàn)為凝視不動(dòng)、咀嚼、吸鼻，提示癲癇行為Racine分級Ⅰ～Ⅱ級，持續(xù)5 min出現(xiàn)反復(fù)的咀嚼、面部抽搐及前肢抖動(dòng)、后退、站立跌倒和旋轉(zhuǎn)等，提示Racine癲癇行為分級Ⅲ～Ⅳ級，發(fā)作間期逐漸縮短，發(fā)作期逐漸延長;唑尼沙胺組及苯巴比妥組大鼠發(fā)作級別降低、潛伏期延長，持續(xù)時(shí)間縮短，具有一定抗癲癇作用。但觀察唑尼沙胺與苯巴比妥相比較起效慢，給藥4 d后2組大鼠在癲癇發(fā)作頻率及發(fā)作持續(xù)時(shí)間上無明顯區(qū)別。

2.2腦電圖改變正常對照組的腦電圖表現(xiàn)為低中幅、相對對稱的正常腦電波。戊四氮致癇大鼠腦電圖表現(xiàn)為:基本背景節(jié)律下可見陣發(fā)性癲癇波。唑尼沙胺組及苯巴比妥組大鼠經(jīng)過藥物干預(yù)，腦電波中的棘波減少，背景節(jié)律較規(guī)整。

2.34組大鼠腦組織NO含量及NOS活性的變化癲癇模型組大鼠經(jīng)腹腔注射戊四氮14 d后，測定NO的含量及NOS活性明顯升高，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);唑尼沙胺組和苯巴比妥組與癲癇模型組大鼠比較，其NO含量及NOS活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1　4組大鼠腦組織NO含量及NOS活性比較n =8±s

表1　4組大鼠腦組織NO含量及NOS活性比較n =8±s

注:與正常對照組比較，*P＜0.05;與癲癇組比較，#P＜0.05

組別　NO(μmol/g)　NOS(U/mg)正常對照組4.01±0.25　0.21±0.02癲癇模型組　11.79±1.03*　0.58±0.05*唑尼沙胺組　7.72±0.92#　0.34±0.05#苯巴比妥組　6.28±0.44#　0.26±0.02#

2.44組大鼠腦組織MDA含量、SOD活性的變化癲癇模型組造模成功后，MDA含量明顯升高，SOD含量明顯減少，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);唑尼沙胺組和苯巴比妥組與癲癇模型組大鼠比較，其腦組織的MDA明顯減少，SOD含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 )。見表2。

2.5病理正常對照組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元排列密集、規(guī)則，腦組織未見明顯損害。而癲癇組海馬神經(jīng)元排列紊亂、疏松，可見腦組織壞死性改變，以海馬CA1、CA3區(qū)明顯;表現(xiàn)神經(jīng)元變性和固縮性壞死。變性的神經(jīng)元腫脹，體積增大。有典型的多角型變?yōu)閳A

表2　4組大鼠MDA含量和SOD活性水平比較n =8±s

表2　4組大鼠MDA含量和SOD活性水平比較n =8±s

注:與正常對照組比較，*P＜0.05;與癲癇模型組比較，#P＜0.05

組別　MDA(nmol/mg)　SOD(U/mg)正常對照組4.3±0.5　53.6±2.5癲癇模型組　15.0±1.4*　23.0±1.9*唑尼沙胺組　9.5±1.2#　33.9±2.7#苯巴比妥組　7.3±0.7#　38.8±3.5#

形或三角形，胞體偏位;壞死的神經(jīng)元胞漿濃縮，深染，核仁不明顯，核固縮、核破裂。唑尼沙胺組及苯巴比妥組大鼠海馬神經(jīng)元經(jīng)藥物干預(yù)均較癲癇組神經(jīng)元排列整齊、密集，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則。見圖1。

圖1　4組大鼠海馬病理(HE×10)

3　討論

癲癇作為一種長期反復(fù)發(fā)作的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，人們對癲癇發(fā)病機(jī)制及治療的研究，主要依靠動(dòng)物模型。戊四氮作為一種興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，根據(jù)其藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，此藥物可以引起動(dòng)物抽搐的迅速發(fā)生。并且這種抽搐發(fā)作可以迅速達(dá)到高峰，持續(xù)較短，能自動(dòng)停止，同時(shí)此模型具有不破壞局部腦組織的結(jié)構(gòu)，不伴有神經(jīng)元損傷、壞死的優(yōu)點(diǎn)［3］，有利于癲癇腦組織形態(tài)學(xué)的觀察。因此戊四氮致癇的動(dòng)物模型是研究癲癇的理想動(dòng)物模型［4］。

目前治療癲癇的基本方法仍是口服抗癲癇藥物。傳統(tǒng)的抗癲癇藥物如苯妥英、卡馬西平、丙戊酸等均因長期服用出現(xiàn)較大的毒性，并且可能存在肝酶代謝異常、半衰期短及產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物等，其副作用較嚴(yán)重，所以在臨床上的應(yīng)用受到限制［5］。唑尼沙胺是一種新型廣譜抗癲癇藥，無傳統(tǒng)大多數(shù)AEDs所含有的酰腺結(jié)構(gòu)，具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和廣譜的抗癲癇活性［6］。唑尼沙胺作為在難治性部分性發(fā)作的癲癇患者添加治療及單藥已顯示出其有效性［7，8］，長期治療也持續(xù)有效［9，10］，且相對于傳統(tǒng)抗癲癇藥物副作用小。已發(fā)現(xiàn)此藥物可通過多種作用機(jī)制發(fā)揮治療癲癇的作用，主要包括: (1)抑制電壓依賴性鈉離子通道; (2)降低T-型鈣離子內(nèi)流［11］; (3)直接改變一些神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放和降解，如GABA、多巴胺、5-HT和乙酰膽堿，這些作用可以增強(qiáng)突觸抑制。但是，NO及氧自由基在唑尼沙胺抗癲癇作用機(jī)制中的作用，筆者尚未見有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過監(jiān)測腦組織NO含量、NOS活性，證實(shí)了癲癇發(fā)作后NO含量升高，引起海馬組織損傷;經(jīng)過唑尼沙胺及苯巴比妥治療后海馬損害程度減輕，且腦組織NO含量及NOS活性降低，提示唑尼沙胺可能通過降低腦組織NO含量或NOS活性而發(fā)揮其抗癲癇的作用。另外，本實(shí)驗(yàn)中癲癇組大鼠腦組織MDA含量升高，SOD活性降低;而經(jīng)過唑尼沙胺干預(yù)治療的大鼠與癲癇組大鼠相比較，MDA含量降低，SOD活性升高，大鼠海馬組織細(xì)胞排列緊密、規(guī)整，提示唑尼沙胺可能通過降低腦組織MDA含量或提高SOD活性起到其神經(jīng)保護(hù)作用。通過本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了唑尼沙胺的抗癲癇治療的有效性，并為我們臨床工作中尋找新的抗癲癇藥物及選用合理的抗癲癇藥物提供借鑒。

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Effect of zonisamide on NO content in brain tissue of rats with epilepsy

CHEN Fang，WANG Lihui，LIU Bin，et al.
Department of Neurology，Hebei Provincial Children’s Hospital，Shijiazhuang 050031，China

【Abstract】Objective To investigate the action mechanism of zonisamide as a new antiepileptic drug.Methods Twenty-four rats with epilepsy induced by pentrazol were randomly divided into three groups: zonisamide group，phenobarbital group，epilepsy model group，with 8 rats in each group，at same time，the other 8 normal rats were used as control group.The contents of NO，MDA and activities of NOS，SOD in brain tissues of the rats were detected for the four groups，meanwhile，the changes of hippocampus tissue structure of the rats were observed.Results The contents of NO，MDA and activity of NOS were significantly increased in epilepsy model group，as compared with those in control group (P＜0.05)，however，the activity of SOD was significantly decreased in epilepsy model group (P＜0.05).The contents of NO，MDA and activity of NOS were significantly decreased in zonisamide group and phenobarbital group，as compared with those in epilepsy model group，however，the activity of SOD was significantly increased in both groups (P＜0.05).Furthermore，zonisamide could improve the structure of hippocampus tissue in rats with epilepsy.ConclusionZonisamide plays an antiepileptic role by reducing the contents of NO in rats with epilepsy.

【Key words】zonisamide; pentrazol; epilepsy; NO; hippocampus

(收稿日期:2014－10－15)

通訊作者:王麗輝，050031石家莊市，河北省兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.003

【文章編號(hào)】1002－7386(2015)06－0812－03

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】R 971.6