王海東　李景東　常學良　王亞軒　韓振偉　滕志?！±璎|　楊書文

作者單位: 050000石家莊市，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科

Wnt3a及Lgr5在膀胱癌中的表達及意義

王海東李景東常學良王亞軒韓振偉滕志海黎瑋楊書文

作者單位: 050000石家莊市，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科

【摘要】目的探討Wnt3a、富含亮氨酸重復序列G-蛋白耦聯(lián)受體(Lgr5)在人膀胱癌組織中的表達和意義。方法應用免疫組織化學法檢測11例正常膀胱組織和39例膀胱癌組織Wnt3a、Lgr5蛋白表達情況，RT-PCR方法檢測9例正常膀胱組織和17例膀胱癌組織中Wnt3a、Lgr5 mRNA的表達情況。結果免疫組化結果顯示: Wnt3a蛋白在膀胱癌與正常膀胱組織表達陽性率分別為79.49%和36.36%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); Lgr5蛋白在膀胱癌與正常膀胱組織表達陽性率分別為74.36%和27.27%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);兩者在膀胱癌中的表達呈正相關(r =0.677，P＜0.01)。RT-PCR結果顯示: Wnt3a在膀胱癌和正常膀胱組織的光密度比值分別為(0.197± 0.029)和(0.088±0.019)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); Lgr5在膀胱癌和正常膀胱組織的光密度比值分別為(0.408±0.061)和(0.161±0.053)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論在膀胱癌組織中Wnt3a、Lgr5蛋白及mRNA的表達均高于正常膀胱組織，提示W(wǎng)nt3a、Lgr5可能與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。

【關鍵詞】Wnt3a; Lgr5;膀胱腫瘤; RT-PCR;免疫組化

E-mail: wangyaxuan87@126.com

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。世界范圍內，膀胱癌的發(fā)病率位居全身惡性腫瘤的第九位，男性居第六位［1］。但其發(fā)病機制目前還不明確。Wnt信號通路是細胞中高度保守的信號傳導途徑，參與調節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt通路的異常激活與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關［2］。Lgr5是Wnt信號通路的靶基因，屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族的成員，是潛在的腫瘤細胞表面分子標志物。本文觀察了Wnt3a、Lgr5在膀胱癌組織中的表達，旨在為膀胱癌的治療提供新的靶點。

1　資料與方法

1.1一般資料搜集2012年4月至2013年9月在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院手術治療患者中的39例膀胱癌組織和11例正常膀胱組織。標本經多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。同時取膀胱癌組織17例，正常膀胱組織9例于術后立即保存于－80℃中備用。所有標本均經病理證實。

1.2實驗試劑瓊脂糖購自于美國Sigma公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒、DNA Marker均購自大連寶生物工程有限公司，PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司設計提供。兔抗人wnt3a多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，兔抗人Lgr5單克隆抗體購自宜康生物技術有限公司，ABC試劑盒購自美國vector公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學方法:常規(guī)石蠟切片脫蠟水化，PBS洗3次，0.3%H2O2浸泡30 min，微波枸櫞酸鹽抗原修復，PBS液洗3次，滴加封閉液，室溫20 min。滴加一抗室溫1 h，PBS洗3次，滴加二抗，室溫20 min，PBS洗3次，滴加試劑SABC室溫20 min，PBS洗3次，DAB顯色，蘇木素復染，脫水封片。每例標本同時以PBS替代一抗作為陰性對照。

1.3.2RT-PCR: Trizol法提取組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA的純度和含量。逆轉錄反應依照大連寶生物工程有限公司逆轉錄試劑盒說明書操作。將逆轉錄產物在PE9600型PCR擴增儀中進行PCR反應。將擴增產物放于瓊脂糖凝膠電泳，電泳后于紫外透射儀觀察，數(shù)碼相機照相，采用Quantity One凝膠圖像分析軟件進行分析，以β-actin電泳作為參照，采用吸光度比值表示結果。

1.3.3結果評定:免疫組化結果判定方法:染色強度分數(shù)標準:無色為0分;淺棕色為1分;棕色為2分;深棕色為3分。高倍鏡下隨機觀察5個視野計數(shù)陽性細胞數(shù)，≤5%為0分; 6%～25%為1分; 26%～50%為2 分;＞50%為3分。將染色強度記分與染色細胞百分數(shù)記分相乘，總記分＜2分為陰性; 2～4分為陽性;＞4分為強陽性。

1.4統(tǒng)計學分析應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗Fisher’s精確概率法，采用pearson相關分析法進行相關指標分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1Wnt3a、Lgr5在膀胱癌、正常膀胱組織中的表達

Wnt3a表達主要分布于細胞質及細胞膜，在膀胱癌組織中表達陽性率明顯高于正常膀胱組織，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); Lgr5表達主要分布于細胞質，在膀胱癌組織表達陽性率明顯高于正常膀胱組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);且兩者在膀胱癌中的表達呈正相關(r =0.677，P＜0.01)。見表1，圖1～4。

表1　Wnt3a、Lgr5在膀胱癌及正常膀胱組織中的表達　例

圖1　正常膀胱組織中Wnt3a的表達(SP×200)

圖2　膀胱癌組織中Wnt3a的表達(SP×200)

圖4　正常膀胱組織中Lgr5的表達(SP×200)

圖5　膀胱癌組織中Lgr5的表達(SP×200)

2.2膀胱癌及正常膀胱組織中Wnt3a、Lgr5在mRNA水平的表達情況為進一步驗證Wnt3a、Lgr5在膀胱癌及正常膀胱組織中表達的差異，采用RT-PCR法檢測Wnt3a、Lgr5在mRNA水平的表達，Wnt3a在膀胱癌和正常膀胱組織的光密度比值分別為(0.197± 0.029)和(0.088±0.019)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); Lgr5在膀胱癌和正常膀胱組織的光密度比值分別為(0.408±0.061)和(0.161±0.053)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖5、6。

圖5　Wnt3a mRNA在正常組織和膀胱癌中的表達及內參(1～5:為正常組織; 6～13為膀胱癌組織)

圖6　Lgr5 mRNA在正常組織和膀胱癌中的表達及內參(1～5:為正常組織; 6～13為膀胱癌組織)

3　討論

Wnt信號通路，是一條多種分子參與的多環(huán)節(jié)、多作用位點的復雜的信號轉導途徑，在細胞的增殖、分化、運動及凋亡等過程中起著重要的調節(jié)作用［3］。研究表明，該途徑的異常激活與許多疾病有關系，尤其是與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關［4］。

Wnt/β-catenin信號通路屬于經典的Wnt信號通路，β-catenin在信號通路中起到核心的作用，啟動因子Wnt蛋白家族成員已經發(fā)現(xiàn)19種，他們屬于富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，通過與細胞表面的特異性受體相互作用，激活下游的信號轉導［5］。Wnt3a能夠穩(wěn)定的激活經典Wnt/β-catenin信號通路，因此本實驗選用其作為上游目標蛋白。

Lgr5又名GPR49，屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族的成員，含有17個富亮氨酸重復序列和7個跨膜結構域，是新近發(fā)現(xiàn)的經典Wnt信號通路的靶基因和潛在的腫瘤干細胞的標志物。研究發(fā)現(xiàn)，Lgr5在結腸癌、肝細胞癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中過表達［7］。

Wnt3a通過激活Wnt信號通路，降解復合物的形成，導致β-catenin在胞漿中的降解減少，并轉入胞核與Tcf/Lef轉錄因子家族成員結合，激活Lgr5基因的轉錄［6］。Lgr5的過量表達可以增強Wnt信號，但其機制目前還不清楚［7］。Malgor等［8］發(fā)現(xiàn)Wnt5a在膀胱癌上的表達明顯高于正常膀胱組織，且病理分期越高，表達水平越高。有外文報道Wnt7b在非浸潤性膀胱癌的早期起到重要作用［9］。Wnt3a在膀胱中的表達鮮有報道。

本研究中，免疫組織化學法顯示W(wǎng)nt3a、Lgr5在膀胱癌中的蛋白表達明顯高于正常膀胱組織，且差異有統(tǒng)計學意義。RT-PCR顯示膀胱癌組織中Wnt3a、Lgr5 在mRNA水平表達明顯升高。Wnt3a、Lgr5兩者的表達呈正相關(r =0.677，P＜0.01)。推測Wnt3a的高表達致經典Wnt信號通路異常激活，激活下游靶基因Lgr5的表達，導致細胞的異常增殖、分化和轉移;過表達的Lgr5又會增強Wnt信號，進一步促進膀胱腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Barker等［10］發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與Lgr5陽性干細胞有關，且Lgr5能啟動Wnt信號通路，促進βcatenin表達。

由此我們可以得出，經典Wnt/β-catenin信號通路的異常激活在膀胱癌的發(fā)病中起到重要作用，Wnt3a、Lgr5的高表達與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，為膀胱癌的靶向治療提供新的靶點。但是由于本實驗的樣本數(shù)偏少，未能證明與膀胱癌病理分期的關系，有待進一步實驗證明。

參考文獻

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Expression and significance of Wnt3a and Lgr5 in bladder cancer

WANG Haidong，LI Jingdong，CHANG Xueliang，etal.
Department of Urology，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China

【Abstract】Objective To investigate the expression and significance of Wnt3a and Lgr5 in bladder cancer.Methods

The expression levels of Wnt3a protein and Lgr5 protein wee detected by immunohistochemistry in 11 cases of normal tissues and 39 cases of bladder cancer tissues.The expression levels of Wnt3a mRNA and Lgr5 mRNA were detected by RT-PCR in 9 cases of normal bladder tissues and 17 cases of bladder cancer tissues.Results The results by immunohistochemistry showed the positive expression rates of Wnt3a protein were 84.6%，33.3% in bladder cancer tissues and normal bladder tissues，respectively，there were significant differences between the two kinds of tissues (P＜0.05).The positive expression rates of Lgr5 protein were 84.6%，33.3% in bladder cancer tissues and normal bladder tissues，respectively，there were significant differences between the two kinds of tissues (P＜0.05).The expression of Wnt3a was positively correlated to that of Lgr5 in bladder cancer tissues (r =0.677，P＜0.01).The results by RT-PCR showed that there was a significant difference in the ratio of optical density of Wnt3a between bladder cancer tissues and normal bladder tissues (P＜0.05)，there was a significant difference in the ratio of optical density of Lgr5 between bladder cancer tissues and normal bladder tissues (P＜0.05).Conclusion The expression levels of the protein and mRNA of Wnt3a and Lgr5 in bladder cancer tissues are much higher than those in normal bladder tissues，which suggest that Wnt3a and Lgr5 may be closely related with the pathogenesis and development of bladder cancer.

【Key words】Wnt3a; Lgr5; bladder neoplasms; RT-PCR; immunohistochemistry

(收稿日期:2014－10－22)

通訊作者:王亞軒，050000石家莊市，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.007

【文章編號】1002－7386(2015)06－0826－03

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 737.14