楊強(qiáng)　常玉林　姚忠?guī)r　劉朝輝

作者單位: 061000河北省滄州市中心醫(yī)院麻醉科

利多卡因?qū)δ摱景Y大鼠預(yù)后的影響

楊強(qiáng)常玉林姚忠?guī)r劉朝輝

作者單位: 061000河北省滄州市中心醫(yī)院麻醉科

【摘要】目的探討利多卡因?qū)δ摱景Y大鼠預(yù)后的影響。方法在96只雄性Wistar大鼠進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)造模。48只大鼠分為對照組(C組)，模型組(CLP組)，早期利多卡因處理組(Lido + CLP組)和晚期利多卡因處理組(CLP + Lido組)，每組12只。每組大鼠分別在CLP后24 h和48 h處死，收集血和肺組織樣品用來檢測血清中HMGB1水平，肺組織中HMGB1 mRNA表達(dá)和重要器官功能指標(biāo);同時另取48只大鼠進(jìn)行生存率分析。結(jié)果血清中HMGB1和肺組織中HMGB1 mRNA呈正相關(guān)(r =0.94，P＜0.05);血清中HMGB1和肺組織中HMGB1 mRNA在CLP組，Lido + CLP組和CLP + Lido組明顯高于C組(P＜0.05);但在Lido + CLP組和CLP + Lido組明顯低于CLP組(P＜0.05)。和CLP組相比，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和肌酸磷酸激酶(CK)水平在Lido + CLP組和CLP + Lido組明顯降低(P＜0.01)。大鼠生存率在Lido + CLP組和CLP + Lido組明顯高于CLP組(P＜0.01)。結(jié)論利多卡因可以明顯改善生存率，抑制HMGB1表達(dá)和保護(hù)膿毒癥大鼠肝、腎、心等重要器官。

【關(guān)鍵詞】利多卡因;高遷移率族蛋白1;膿毒癥

膿毒癥引起的全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)是嚴(yán)重?zé)齻?，感染，?chuàng)傷或休克患者的主要死因。一項流行病學(xué)調(diào)查顯示，膿毒癥發(fā)生率正以每年1.5%～8%的速度增加［1］，這對人類健康構(gòu)成巨大威脅。最近幾年許多臨床治療方法包括抗炎策略和液體替換用于治療膿毒癥［2，3］。然而這些方法的有效性并沒有很大進(jìn)展，且膿毒癥相關(guān)的發(fā)病率和病死率仍然增加。因此我們發(fā)現(xiàn)新的臨床干預(yù)方法和藥學(xué)方法處理膿毒癥變得至關(guān)重要。高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一個非組氨酸核蛋白，原先認(rèn)為它通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子到同源的DNA序列［4］，在調(diào)節(jié)基因信息上扮演重要角色。HMGB1在膿毒癥發(fā)生機(jī)制上是一個重要晚期炎性介質(zhì)［5］。HMGB1抗體，特異性拮抗劑或者其他藥物制劑等吉抗HMGB1治療在許多臨床前炎癥疾病模型上有良好效果，并且減緩這些疾病的嚴(yán)重性和降低其病死率［6］。利多卡因是一種局部麻醉藥被廣泛用于臨床實踐。最近研究發(fā)現(xiàn)利多卡因可以抑制炎性反應(yīng)和降低內(nèi)毒素休克大鼠病死率［7］。然而很少研究做了利多卡因?qū)δ摱景Y大鼠心肝腎等重要器官功能和HMGB1表達(dá)的影響。在本研究中，大鼠膿毒癥用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)制備，用來觀察利多卡因?qū)ρ逯蠬MGB1分泌和肺組織中HMGB1 mRNA表達(dá)以及血清中谷丙酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、肌酸磷酸激酶(CK)水平的影響。本研究的目的是探討利多卡因?qū)δ摱景Y病死率，重要器官功能和HMGB1表達(dá)的效果。

1　材料與方法

1.1動物與試劑48只健康雄性清潔級Wistar大鼠，體重250～300 g，這些動物由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號: 905713。Trizol(Invitrogen公司，美國);大鼠HMGB1酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海滬尚生物科技公司);大鼠HMGB1和GAPDH擴(kuò)增引物(上海英俊公司)。

1.2動物模型建立和管理所有大鼠在手術(shù)前12 h空腹，隨后腹腔注射10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)并緊接著背側(cè)臥位固定。大鼠膿毒癥模型用CLP制備，一條1.5 cm切口沿著盲腸根部和腹中線切開。盲腸壁穿刺3次沿著結(jié)扎側(cè)用18 G，隨后進(jìn)行引流以阻止穿刺孔被腸內(nèi)容物堵塞。腸管放回腹腔隨后縫合腹膜腔和皮膚。在對照組僅進(jìn)行腹部切開，盲腸分離和腹腔關(guān)閉。所有大鼠快速給予皮下注射0.9%氯化鈉溶液按照術(shù)后3 ml/100 g給予。上述麻醉和固定后在CLP之前進(jìn)行右頸內(nèi)靜脈分離，隨后成功置入頸內(nèi)靜脈24G套管針，這個套管針與微量注射泵相連。隨機(jī)分為4組，對照組(C組)，模型組(CLP組)，早期利多卡因處理組(Lido + CLP組)和晚期利多卡因處理組(CLP + Lido組，每組12只)。在C組0.9%氯化鈉溶液(NS)替代利多卡因。Lido + CLP組和CLP + Lido組給予靜脈注射利多卡因(4 mg/kg)在CLP前或后1 h。大鼠的臨床表現(xiàn)進(jìn)行觀察。每組隨機(jī)挑選每組6只大鼠分別在CLP后24 h和48 h殺死后收集樣品。另外48只大鼠(每組12只)按照在C組，CLP組，Lido + CLP組和CLP + Lido組的方法在CLP后48 h進(jìn)行處理并計算生存率。

1.3標(biāo)本處理大鼠在腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，5 ml血樣從心臟采集隨后在3 000 r/min離心10 min。血清進(jìn)行收集然后用EDTA處理。100 mg肺組織和收集的血清儲存在－80℃用于將來進(jìn)行研究。

1.4檢測血清中HMGB1水平血清中HMGB1水平用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測按照試劑盒說明書檢測(上海滬尚生物科技公司，上海)。

1.5檢測CLP 24 h后血清中生化參數(shù)血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK用自動生化分析儀檢測。

1.6探測肺組織中HMGB1 mRNA表達(dá)100 mg肺組織制成勻漿后，總RNA用Trizol(Invitrogen公司，美國)進(jìn)行一部提取法抽提，并且隨后RNA濃度用紫外分光光度計進(jìn)行檢測。逆轉(zhuǎn)錄用2 μg總RNA獲得cDNA，作為實時熒光定量PCR的模板。GAPDH作為內(nèi)部參考基因和HMGB1作為靶基因獲得HMGB1和GAPDH在GeneBank的信使RNA序列。特異性引物用Prime5軟件設(shè)計并且由上海英俊生物科技公司合成(上海，中國)。HMGB1基因序列(158 bp):上游序列是5’-CCATTGGTGATGTTGCAAAG-3’;下游序列是5’-CTTTTTCGCTGCATCAGGTT-3’。GAPDH基因序列:上游序列是5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3’;下游序列是5’-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3’。實時熒光定量PCR在25 μl容積體系進(jìn)行，體系含有0.5 μl(10 mmol/L)上游和下游引物。12.5 μl 2 倍SYBR Green Mix和雙蒸水。擴(kuò)增條件如下:預(yù)變性在95℃2 min; 94℃15 s，58℃15 s，72℃15 s，40循環(huán);收集熒光在72℃。Ct值獲得用于統(tǒng)計HMGB1 mRNA的相對表達(dá)量和HMGB1與GAPDH基因的比例。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析(ANOVA)，Kaplan Meier用作對比組間存活率，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況和病死率在CLP組大鼠出現(xiàn)行動遲緩，食欲減低，嗜睡，豎毛，腹瀉，和眼分泌物增多.隨著膿毒癥的進(jìn)展發(fā)生窒息并且一些大鼠死亡。尸檢顯示在腹腔中有更多血和化膿性滲出，腸管擴(kuò)張，和黑色腫大的盲腸。在CLP后48 h，CLP組，Lido + CLP組和CLP + Lido組的死亡數(shù)分別是8、3和4只。CLP具有明顯的致死效果，利多卡因可以顯著改善生存率，在對照組無死亡并且大鼠生存率在CLP組低于LidoCLP組和CLP + Lido組(P＜0.01)。見表1。

表1　4組CLP后48h大鼠存活率比較n =12，只(%)

2.2利多卡因?qū)ρ逯蠬MGB1的效果在膿毒癥模型建立后24 h和48 h，CLP組、Lido + CLP組和CLP + Lido組血清HMGB1水平高于對照組(P＜0.05)，血清HMGB1水平在CLP組、Lido + CLP組和CLP + Lido組中48 h水平低于膿毒癥模型建立后24 h(P＜0.05)。血清HMGB1水平在相同時間點Lido + CLP組和CLP + Lido組比CLP組低(P＜0.01)。在每個相同時間點Lido + CLP組和CLP + Lido組血清HMGB1水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2　4組CLP后24 h和48 h大鼠血清中HMGB1水平比較n =6，±s

表2　4組CLP后24 h和48 h大鼠血清中HMGB1水平比較n =6，±s

注:與C組比較，*P＜0.05;與CLP組比較，#P＜0.01

組別24 h　48 h C組4.5±0.4　4.8±0.5 CLP組　14.2±1.3*　13.8±1.2*Lido + CLP組　9.1±1.1* #　8.7±0.9* #CLP + Lido組　11.9±1.1* #　10.8±1.2*#

2.3利多卡因?qū)LP后24 h血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK的影響與對照組相比，血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK在CLP組、Lido + CLP組和CLP + Lido組顯著增加(P＜0.05)。與CLP組相比，血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK在Lido + CLP組和CLP + Lido組的每個相同時間點水平均降低(P＜0.01)。血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK在Lido + CLP組和CLP + Lido組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3　利多卡因?qū)LP后24 h生化參數(shù)的效果n =6±s

表3　利多卡因?qū)LP后24 h生化參數(shù)的效果n =6±s

注:與對照組比較，*P＜0.05;與CLP組比較，#P＜0.01

組別　ALT(U/L)　AST(U/L)　BUN(mmol/L)　Cr(mmol/L)　CK(U/L)C組43±5　150±18　5.8±1.0　23±3　236±25 CLP組　215±31*　590±102*　21.6±3.7*　58±9*　834±153* Lido + CLP組　101±15* #　340±58* #　13.5±2.1* #　46±5* #　552±124* # CLP + Lido組　124±23* #　373±61* #　11.8±2.7* #　48±7* #　511±112*#

2.4利多卡因?qū)Ψ谓M織HMGB1 mRNA表達(dá)的影響以及血清中HMGB1和肺組織HMGB1 mRNA的相關(guān)性血清中HMGB1和肺組織中HMGB1 mRNA呈正相關(guān)(r =0.94，P＜0.05)。在CLP模型建立后24 h 和48 h，對照組中肺組織HMGB1 mRNA有弱表達(dá)。在CLP組中肺組織HMGB1 mRNA表達(dá)在CLP后24 h達(dá)到峰值，但在CLP后48 h降低。在相同時間點肺組織中HMGB1 mRNA表達(dá)在CLP組高于Lido + CLP組和CLP + Lido組(P＜0.01)。在相同時間點HMGB1 mRNA表達(dá)在Lido + CLP組和CLP + Lido組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表4。

表4　4組CLP后24 h和48 h肺組織中HMGB1 mRNA表達(dá)n =6，±s

表4　4組CLP后24 h和48 h肺組織中HMGB1 mRNA表達(dá)n =6，±s

注:與C組比較，*P＜0.05;與CLP組比較，#P＜0.01

組別24 h　48 h C組0.53±0.15　0.46±0.02 CLP組　2.91±0.17*　2.31±0.70*Lido + CLP組　1.75±0.03* #　1.47±0.17* #CLP + Lido組　1.96±0.06* #　1.59±0.11*#

3　討論

CLP誘發(fā)膿毒癥休克大鼠模型并且應(yīng)用到本研究的模型也叫做混合性膿毒癥模型。和脂多糖誘發(fā)的內(nèi)毒素休克模型相比，CLP模型可以反映更多臨床上膿毒癥休克的典型特征。觀察我們研究中大鼠的臨床表現(xiàn)，應(yīng)用到本研究的膿毒癥模型是成功的。資料顯示CLP后早期病死率高達(dá)50%［8］。目前利多卡因主要用于局部麻醉，所以CLP后48 h大鼠生存率在本研究中進(jìn)行觀察。我們結(jié)果顯示利多卡因可以明顯改善CLP后大鼠生存率，本研究和Pan等［7］報道的利多卡因顯著增加內(nèi)毒素休克大鼠生存率一致。

HMGB1是一種非組氨酸蛋白并且由Xiang等［9］在1999年首先報道。HMGB1作為一個新的潛在的晚期炎性介質(zhì)參與膿毒癥的發(fā)病機(jī)制，并被認(rèn)為是最重要晚期炎性介質(zhì)，它在膿毒癥中具有致死效果［9］。Kuroda等［10］報道了血清中HMGB1表達(dá)水平和試驗性動物膿毒癥進(jìn)展和嚴(yán)重性密切相關(guān)。我們研究顯示和對照組相比，HMGB1在相同時間點血清中和肺組織中在CLP組和利多卡因組顯著增加(P＜0.05);隨后給予利多卡因HMGB1水平在利多卡因組低于CLP 組;并且血清中HMGB1和肺組織中HMGB1 mRNA呈正相關(guān)(r =0.94，P＜0.05)。這些結(jié)果顯示利多卡因可以通過抑制血清和肺組織中HMGB1在膿毒癥中扮演重要角色，并且改善膿毒癥大鼠的預(yù)后。

對于膿毒癥患者經(jīng)常合并多器官功能衰竭的，一個重要的臨床選藥原則是這個藥物是否會對重要器官產(chǎn)生保護(hù)效果。在本研究中對重要器官的功能改變進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示和CLP組相比，Lido + CLP組和CLP + Lido組在CLP后24 h血清中ALT，AST，BUN，Cr，CK水平明顯降低，顯示利多卡因?qū)δ摱景Y大鼠重要器官具有保護(hù)效果。許多研究顯示巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞在各種休克和膿毒癥模型中是重要的促炎細(xì)胞因子來源。Jiao等［11］報道枯否細(xì)胞被認(rèn)為是膿毒癥急性期促炎因子的一個主要來源。在本研究中利多卡因是否通過特異性枯否細(xì)胞反應(yīng)具有肝臟保護(hù)效果仍有待進(jìn)一步研究。

一些重要問題仍有待進(jìn)一步闡明，例如什么是利多卡因?qū)δ摱景Y大鼠重要器官保護(hù)效果的具體機(jī)制，利多卡因參與的保護(hù)效果與HMGB1的關(guān)系是什么，這是我們研究的局限性。利多卡因抑制HMGB1水平的機(jī)制尚不清楚，但可能與下列因素有關(guān):利多卡因可以降低膿毒癥動物NO水平，NO可以產(chǎn)生對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害，并且NO和HMGB1密切相關(guān)［12］;利多卡因可以降低膿毒癥大鼠肝臟細(xì)胞NF-κB活性，來抑制像TNF-α等促炎細(xì)胞因子水平顯示具有抗炎作用;利多卡因可以抑制ONOO-活性，一種強(qiáng)氧化劑，來阻斷內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ONOO-介導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)移，部分抑制NF-κB活性導(dǎo)致的炎性級聯(lián)反應(yīng)信號擴(kuò)增。NF-κB參與HMGB1/RAGE信號傳導(dǎo)，所以抑制NF-κB活性可以導(dǎo)致HMGB1降低。

總之在膿毒癥大鼠血清中HMGB1和肺組織中HMGB1 mRNA密切相關(guān)。利多卡因可以抑制HMGB1 和HMGB1 mRNA，并且明顯改善膿毒癥大鼠的生存率。利多卡因在改善膿毒癥大鼠預(yù)后上扮演重要角色。與此同時利多卡因?qū)δ摱景Y大鼠的肝，腎和心臟具有保護(hù)效果。本研究對膿毒癥或膿毒性休克患者提供新的選擇。然而需要進(jìn)一步研究利多卡因在膿毒癥中扮演抗炎角色的具體機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

1 Yang Q，Liu X，Yao Z，et al.Penehyclidine hydrochloride inhibits the release of high-mobility group box 1 in lipopolysaccharide-activated RAW264.7 cells and cecal ligation and puncture-induced septic mice.J Surg Res，2014，186: 310-317.

2 Wang H，Liu D.Baicalin inhibits high-mobility group box 1 release and improves survival in experimental sepsis.Shock，2014，41: 324-330.

3 Lee SA，Kwak MS，Kim S，et al.The role of high mobility group box 1 in innate immunity.Yonsei Med J，2014，55: 1165-1176.

4 Bhutada S，Basak T，Savardekar L，et al.High mobility group box 1 (HMGB1)protein in human uterine fluid and its relevance in implantation.Hum Reprod，2014，29: 763-780.

5 Aslani F，Schuppe HC，Guazzone VA，et al.Targeting high mobility group box protein 1 ameliorates testicular inflammation in experimental autoimmune orchitis.Hum Reprod，2015，30: 417-431.

6 Mudaliar H，Pollock C，Ma J，et al.The role of TLR2 and 4-mediated inflammatory pathways in endothelial cells exposed to high glucose.PLoS One，2014，9: e108844.

7 Pan Q，Liu Y，Zhu X，et al.Chloral hydrate-dependent reduction in the peptidoglycan-induced inflammatory macrophage response is associated with lower expression levels of toll-like receptor 2.Exp Ther Med，2014，7: 1305-1310.

8 Yao L，Kan EM，Kaur C，et al.Notch-1 signaling regulates microglia activation via NF-κB pathway after hypoxic exposure in vivo and in vitro.PLoS One，2013，8: e78439.

9 Xiang K，Cheng L，Luo Z，et al.Glycyrrhizin Suppresses the Expressions of HMGB1 and Relieves the Severity of Traumatic Pancreatitis in Rats.PLoS One，2014，9: e115982.

10 Kuroda N，Inoue K，Ikeda T，et al.Apoptotic response through a high mobility box 1 protein-dependent mechanism in LPS/GalN-induced mouse liver failure and glycyrrhizin-mediated inhibition.PLoS One，2014，9: e92884.

11 Jiao SF，Sun K，Chen XJ，et al.Inhibition of tumor necrosis factor alpha reduces the outgrowth of hepatic micrometastasis of colorectal tumors in a mouse model of liver ischemia-reperfusion injury.J Biomed Sci，2014，8: 1-8.

12 Wang HL，Liu YY，Yan HD，et al.Intraoperative systemic lidocaine inhibits the expression of HMGB1 in patients undergoing radical hysterectomy.Int J Clin Exp Med，2014，15: 3398-3403.

Effects of lidocaine on prognosis of rats with sepsis

YANG Qiang，CHANG Yulin，YAO Zhongyan，et al.
Department of

Anesthesiology，Cangzhou Central Hospital，Hebei，Cangzhou 061000，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effects of lidocaine on prognosis of rats with sepsis.Methods The animal models were established by cecal ligation and puncture (CLP)in 96 male Wistar rats in which 48 rats were divided into four groups: control group (group C)，model group (CLP group)，early lidocaine treatment group (Lido + CLP group)and late lidocaine treatment group (CLP + Lido group)，with 12 rats in each group.The rats were sacrificed at 24h and 48h after CLP，respectively，then blood and lung tissue samples were collected for detecting the serum levels of high mobility group box-1 (HMGB1)，the expression levels of HMGB1 mRNA in lung tissue and the functional parameters in important organs.Furthermore the survival rates were observed in the other 48 rats.ResultsThe serum levels of HMGB1 were positively correlated to the expression levels of HMGB1 mRNA in lung tissue (r =0.94，P＜0.05).The serum levels of HMGB1 and expression levels HMGB1 mRNA in lung tissue in CLP group，Lido + CLP group and CLP + Lido group were significantly higher than those in group C (P＜0.05)，however，which in Lido + CLP group and CLP + Lido group were obviously lower than those in CLP group (P＜0.05).As compared with those in CLP group，the levels of alanine aminotransferase (ALT)，aspartate aminotransferase (AST)，blood urea nitrogen (BUN)，creatinine (Cr)，creatine kinase (CK)were significantly decreased in Lido + CLP group and CLP + Lido group (P＜0.01).The survival rates of rats in Lido + CLP group and CLP + Lido group were significantly higher than those in CLP group (P＜0.01).ConclusionLidocaine can significantly improve the survival rate，inhibit HMGB1 expression and protect important organs such as liver，kidney and heart in rats with sepsis.

【Key words】lidocaine; high mobility group box-1; sepsis

(收稿日期:2014－09－22)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.010

【文章編號】1002－7386(2015)06－0836－04

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【中圖分類號】R 446.112