賈蓓蕾，魏濤，黃申，賈春曉，楊靖，張改紅，白冰，毛多斌

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州，450002)

類(lèi)胡蘿卜素是由8個(gè)類(lèi)異戊二烯單元組成的多烯類(lèi)物質(zhì)，是C40類(lèi)萜化合物及其衍生物的總稱(chēng)，呈黃色、紅色或橙紅色［1］。常見(jiàn)重要類(lèi)胡蘿卜素有α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、六氫番茄紅素、八氫番茄紅素和葉黃素等。類(lèi)胡蘿卜素經(jīng)過(guò)酶催化或光氧化可分解產(chǎn)生 C-13，C-11，C-10，C-9 衍生物，包括 α-紫羅蘭酮、α-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和β-大馬酮等重要的香料物質(zhì)，在制備食品用香精和香料方面具有重要應(yīng)用價(jià)值［2-3］。

目前對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素降解方法主要有物理法和化學(xué)法［4-5］，其中物理降解條件不夠溫和，化學(xué)方法沒(méi)有選擇性。生物降解法是近年發(fā)展起來(lái)的高效降解類(lèi)胡蘿卜素方法，該方法不僅具有高度選擇性，而且微生物種類(lèi)多、含酶豐富，可進(jìn)行多種生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。到目前為止，β-胡蘿卜素生物降解及其香味產(chǎn)物的研究較多，而α-胡蘿卜素和葉黃素相關(guān)研究還較少［6］。本文利用微生物學(xué)方法從煙葉中篩選到α-胡蘿卜素降解菌株Saccharomyces cerevisiae strain ULI3，并優(yōu)化了該菌株發(fā)酵液降解α-胡蘿卜素的活性，為類(lèi)胡蘿卜素生物降解以及降解產(chǎn)物工業(yè)化應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

篩菌樣品:玉溪KC3F烤煙煙葉，產(chǎn)地云南。

試劑及儀器:α-胡蘿卜素標(biāo)樣(百靈威科技有限公司);α-胡蘿卜素底物(純度90%，陜西帕尼爾生物科技有限公司);GC-MS色譜聯(lián)用儀(Agilent 7890C，Agilent公司);梯度PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)，2600 UC/VIS紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)UNIC公司);冷凍離心機(jī)(J6-MI，美國(guó)Beckman公司)。

富集培養(yǎng)基［7］:K2HPO4(1 g/L)、MgSO4·7H2O(0.5 g/L)、NaNO3(3 g/L)、FeSO4·7H2O(0.01 g/L)、KCl(0.5 g/L)、蔗糖(30 g/L)、酵母浸粉(3 g/L)。

發(fā)酵培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基:在富集培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加 15 g/L α-胡蘿卜素。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的篩選［8］

1.2.1.1 初篩

稱(chēng)取10 mg煙葉于250 mL三角瓶中，加入100 mL無(wú)菌水浸泡24 h，抽濾，取濾液2 mL加到富集培養(yǎng)基中，28℃、轉(zhuǎn)速150 r/min培養(yǎng)2 d，得到菌源。取適量菌源進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)x擇10-3，10-4，10-5三個(gè)濃度梯度在分離培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布，每個(gè)濃度梯度平行涂布3個(gè)平板，同時(shí)對(duì)不含有底物α-胡蘿卜素的平板進(jìn)行涂布作為對(duì)照組。將涂布好的平板于培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)2～3 d，挑選出形態(tài)較好，有透明圈產(chǎn)生的單菌落，反復(fù)進(jìn)行劃線(xiàn)分離純化。

1.2.1.2 復(fù)篩

挑選出透明圈較為明顯的單菌落接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中28℃、轉(zhuǎn)速150 r/min培養(yǎng)2 d，通過(guò)觀察搖瓶顏色，以及GC-MS分析檢測(cè)降解產(chǎn)物，進(jìn)一步篩選具有降解α-胡蘿卜素能力的菌株。

1.2.2 GC-MS分析檢測(cè)降解產(chǎn)物［9］

1.2.2.1 降解產(chǎn)物萃取

取100 mL發(fā)酵液，于250 mL分液漏斗中加入等體積的分析純二氯甲烷，緩緩搖晃，使兩相混合均勻，靜置20 min后收集有機(jī)相，重復(fù)以上步驟3次，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷后，加入1 mL色譜純二氯甲烷溶解，過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜后，于4℃低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆茫陨喜僮骶诒芄猸h(huán)境中進(jìn)行。

1.2.2.2 降解產(chǎn)物分析檢測(cè)［10］

色譜條件:HP-5色譜柱30m×0.25mm×0.25μm;載氣為氦氣，流速為1mL/min;程序升溫:40℃，保持2.5 min，以2℃/min的升溫速度升至280℃并保持5 min;進(jìn)樣量為2 μL;分流比為0。

MS分析條件:溶劑延遲6 min，質(zhì)譜掃描范圍35～455 aum，傳輸線(xiàn)溫度280℃，離子源為EI源，EI電子能量70 eV。定性和定量分析時(shí)，分別采用全掃描(Scan)和選擇離子掃描(SIM)模式。

1.2.3 降解產(chǎn)物降解率測(cè)定

α-胡蘿卜素儲(chǔ)備液的配制［11］:避光條件下，稱(chēng)取1 mg α-胡蘿卜素，溶于5 mL的分析純二氯甲烷中，待α-胡蘿卜素徹底溶解后加入0.1 g Tween-80進(jìn)行乳化，減壓濃縮除去二氯甲烷，得到分散均勻的胡蘿卜素，加入10 mL無(wú)菌水溶解得到0.1mg/mL α-胡蘿卜素儲(chǔ)備液，待用。

α-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備:分別量取0、30、50、100、200、400、500、700、800、900 μL α-胡蘿卜素儲(chǔ)備液于10支25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，分光光度法測(cè)460 nm處吸光度，以蒸餾水為空白對(duì)照，根據(jù)所得數(shù)據(jù)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到線(xiàn)性方程為y=0.276 5x+0.005(R2=0.999 9)。式中，x為 α-胡蘿卜素水溶液濃度，μg/mL;y為α-胡蘿卜素水溶液的吸光度。

降解率的測(cè)定:采用分光光度法。以培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入1 mL濃度為1 mg/mL的α-胡蘿卜素儲(chǔ)備液，分別在發(fā)酵前和發(fā)酵24 h后測(cè)定吸光度，其降解率按公式(1)計(jì)算:

1.2.4 菌株鑒定［12］

1.2.4.1 形態(tài)觀察

菌體經(jīng)過(guò)結(jié)晶紫染色2 min后，分別在低倍鏡與高倍鏡下觀察菌株形態(tài)。

1.2.4.2 ITS序列擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取目標(biāo)菌株基因組DNA，PCR反應(yīng)引物為真菌 ITS序列通用引物5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(正向)和5'-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3’(反向)，引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系:10 μL 10×PCR buffer，1μL 基因模板，5 μL 2.5 mmol/L dNTP Mixture，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，1 μL Tag酶，81 μL無(wú)菌水。測(cè)序由上海生物工程有限公司完成。系統(tǒng)發(fā)育分析根據(jù)其16S rRNA基因序列用

MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，使用Neighbor-Joining法進(jìn)行1 000次步長(zhǎng)計(jì)算。

1.2.5 菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化［13］

1.2.5.1 碳源影響

選擇蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖和果糖5種碳源，其余成分相同(發(fā)酵培養(yǎng)基)，比較α-胡蘿卜素降解能力，選擇最佳碳源。

根據(jù)所選擇的最佳碳源，取其不同質(zhì)量濃度(10、30、50、70、90 g/L)進(jìn)行培養(yǎng)，研究碳源質(zhì)量濃度對(duì)α-胡蘿卜素降解能力的影響。

1.2.5.2 氮源影響

在最佳碳源條件下，選擇NaNO3、(NH4)2SO4、胰蛋白胨和尿素4種氮源，比較其α-胡蘿卜素降解能力，確定最佳氮源。

根據(jù)所選擇的最佳氮源，取其不同質(zhì)量濃度(1、3、5、7、9)進(jìn)行培養(yǎng)，研究氮源質(zhì)量濃度對(duì) α-胡蘿卜素降解能力的影響。

1.2.5.3 酵母粉影響

在最佳碳源和氮源條件下，比較不同濃度酵母粉(1、3、5、7、9)對(duì) α-胡蘿卜素降解能力的影響。

1.2.5.4 初始pH值影響

選擇最佳濃度碳源、氮源、酵母粉配制發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)置不同 pH 值(5、6、7、8、9)，比較胡蘿卜素降解率，確定最佳初始pH值。

1.2.5.5 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇4個(gè)影響較大因素進(jìn)行4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 α-胡蘿卜素降解菌的篩選

從煙葉中共篩選到5株降解α-胡蘿卜素的菌株，分別接種于含有α-胡蘿卜素底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)分光光度法分別測(cè)定其降解能力。由圖1可知，菌株ULI3的α-胡蘿卜素降解能力最高，其降解率為89.74%。α-胡蘿卜素在菌株ULI3作用下形成多種降解產(chǎn)物，經(jīng)GC-MS分析(圖2)檢測(cè)出28個(gè)揮發(fā)性的化合物，主要包括酮類(lèi)、醛類(lèi)、醇類(lèi)、烯烴類(lèi)、芳烴類(lèi)以及少量的酸類(lèi)和酯類(lèi)化合物。其中，5，6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮(6.15%)、β-紫羅蘭酮(5.1%)、二氫獼猴桃內(nèi)酯(3.12%)、2-羥基-3，5，5-三甲基-2-環(huán)己烯酮(1.69%)、異佛爾酮(1.51%)、β-環(huán)檸檬醛(1.1%)、2，6，6-三甲基-1-環(huán)己烯基乙醛(0.8%)、2，2，6-三甲基環(huán)己酮(0.64%)等是重要的香料物質(zhì)(表1)。因此，菌株ULI3具有降解α-胡蘿卜素產(chǎn)香的能力，可以作為模式菌株研究α-胡蘿卜素降解及產(chǎn)物分析。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

將菌株ULI3接種于固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)36 h后長(zhǎng)出菌落，48 h后平板顏色基本褪完(如圖3所示)。菌落表面有光澤，邊緣整齊，中心有隆起;染色后在光學(xué)顯微鏡(×100或×400)下觀察，菌體多為橢球形和卵形，直徑5～10 μm，進(jìn)行單極出芽生殖(如圖3所示)。

2.2.2 進(jìn)化樹(shù)分析

利用真菌ITS rDNA特征性引物對(duì)菌株ULI3基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到820 bp目的序列。NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast同源序列分析，發(fā)現(xiàn)菌株ULI3與酵母屬(Saccharomyces)具有98%以上的同源性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明(如圖4所示)，菌株ULI3與釀酒酵母聚為一類(lèi)。初步鑒定菌株ULI3為釀酒酵母(S.cerevisiae)。

2.3 菌株ULI3發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 碳源影響

由圖5可知，對(duì)α-胡蘿卜素降解率而言，蔗糖＞乳糖＞麥芽糖＞葡萄糖＞果糖，蔗糖作為碳源降解效果明顯優(yōu)于其他碳源。蔗糖作為非還原性雙糖，可以緩慢被菌體利用，既提供了菌體生長(zhǎng)必需的碳源和能量，又能保證菌體充分降解α-胡蘿卜素底物。葡萄糖是還原性單糖，可以快速被菌體徹底利用，從而導(dǎo)致胡蘿卜素降解率偏低。乳糖和淀粉不易水解，因此也不容易被利用。

由圖6可見(jiàn)，蔗糖濃度對(duì)降解率有比較明顯的影響。在蔗糖濃度10～30 g/L內(nèi)，其降解率隨著蔗糖濃度的增加而增高，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，其降解率最高，之后，隨著蔗糖濃度增加，降解率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖質(zhì)量濃度在30 g/L以下時(shí)，碳源濃度偏低，不能保證菌體的正常生長(zhǎng)，從而也達(dá)不到最優(yōu)降解效果。當(dāng)碳源質(zhì)量濃度在30 g/L以上時(shí)，菌體優(yōu)先利用充足的蔗糖，因此不能很好地降解胡蘿卜素底物，并且會(huì)隨著蔗糖濃度的增加，降解效果會(huì)越來(lái)越差。蔗糖為30 g/L時(shí)，菌體既能正常生長(zhǎng)，又能徹底降解底物。因此，蔗糖最佳質(zhì)量濃度為3%。

2.3.2 氮源影響

由圖7可以看出，菌株ULI3在以NaNO3為氮源的培養(yǎng)基中，對(duì)α-胡蘿卜素的降解能力最高。不同質(zhì)量濃度(1、3、5、7、9 g/L)NaNO3對(duì)降解率影響明顯(如圖8所示)。NaNO3質(zhì)量濃度低于3 g/L時(shí)，其降解率隨著NaNO3濃度的增加而增高，NaNO3為3 g/L時(shí)，降解率最高，NaNO3高于3 g/L時(shí)，降解率呈下降趨勢(shì)。氮源過(guò)多，會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，pH偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累。因此，選擇氮源NaNO3最佳質(zhì)量濃度為3 g/L。

2.3.3 酵母粉影響

由圖9可以看出，酵母粉對(duì)降解率的影響很明顯。菌體在酵母粉濃度為0.3%的培養(yǎng)基中，對(duì)α-胡蘿卜素的降解能力最高，隨著酵母粉濃度的減小或增大，降解率變低。酵母粉濃度為0.3%時(shí)，既給菌體補(bǔ)充了足夠的營(yíng)養(yǎng)，保證菌體正常生長(zhǎng)，又能徹底降解底物。因此，酵母粉的最佳濃度為0.3%。

2.3.4 初始pH值影響

從圖10可以看出，發(fā)酵液的初始pH對(duì)降解率影響很大，在初始pH＜8時(shí)，菌種降解能力隨pH的增大而升高，初始pH＞8時(shí)，降解率大幅度下降。因此，確定菌株ULI3最適初始pH為8。

2.3.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取蔗糖濃度、NaNO3濃度、酵母粉濃度和初始pH值4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。具體水平設(shè)置見(jiàn)表2。

由表3可以看出，極差R的大小依次為C＞B＞D＞A，這說(shuō)明因素對(duì)降解率的影響順序是酵母粉濃度＞氮源濃度＞起始pH＞碳源濃度。根據(jù)表4方差分析結(jié)果可知酵母粉對(duì)降解率影響顯著。由所得數(shù)據(jù)得最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B3C2D2，即蔗糖濃度30 g/L，硝酸鈉質(zhì)量濃度4 g/L，酵母質(zhì)量粉濃度3 g/L，起始pH值為8。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，α-胡蘿卜素降解率為97.13%。

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

3 結(jié)論

從煙葉中篩選到1株高效降解α-胡蘿卜素的菌株ULI3，在含有α-胡蘿卜素(15 mg/L)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行降解，α-胡蘿卜素降解率達(dá)到89.74%，其中降解產(chǎn)物主要是 5，6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯等香味物質(zhì)。通過(guò)經(jīng)典形態(tài)學(xué)和ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，初步鑒定菌株ULI3為釀酒酵母(S.cerevisiae)。在研究蔗糖濃度、NaNO3質(zhì)量濃度、酵母粉濃度和初始pH各單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)得出了菌株ULI3培養(yǎng)液降解α-胡蘿卜素的最佳培養(yǎng)條件:蔗糖質(zhì)量濃度30 g/L，NaNO34 g/L，酵母粉3 g/L和初始pH值為8。采用該培養(yǎng)條件，α-胡蘿卜素降解率達(dá)到97.13%。類(lèi)胡蘿卜素生物降解及降解產(chǎn)生香味物質(zhì)在食品、香料和化工領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。

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