羅文彥　成媛　胡藹園　左連富　何麗英

作者單位: 050200石家莊市，河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室(羅文彥、成媛)，組織胚胎學(xué)教研室(胡藹園)，人體解剖學(xué)教研室(何麗英) ;河北醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所(左連富)

食管鱗狀細(xì)胞癌中DMBT1和CD44v6的表達(dá)及意義

羅文彥成媛胡藹園左連富何麗英

作者單位: 050200石家莊市，河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室(羅文彥、成媛)，組織胚胎學(xué)教研室(胡藹園)，人體解剖學(xué)教研室(何麗英) ;河北醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所(左連富)

【摘要】目的探討食管鱗狀細(xì)胞癌組織中抑癌基因DMBT1以及粘附分子CD44v6的表達(dá)及與腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)70例食管鱗狀細(xì)胞癌組織及23例切緣正常組織中DMBT1、CD44v6的表達(dá)情況。結(jié)果DMBT1、CD44v6在癌組織中的表達(dá)減弱或呈陰性。DMBT1的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌組織的分化程度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與癌組織的浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P＞0.05)。CD44v6的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌組織的淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與癌組織的分化程度、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P＞0.05)。結(jié)論DMBT1的表達(dá)減弱是食管鱗狀細(xì)胞癌組織低分化和高度惡性的生物學(xué)標(biāo)志，并與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，CD44v6主要與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】食管鱗狀細(xì)胞癌; DMBT1; CD44v6;免疫組織化學(xué)

項(xiàng)目來(lái)源:河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(編號(hào): 20120271)

E-mail: luowy@126.com

食管癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而腫瘤轉(zhuǎn)移是大多數(shù)腫瘤患者的重要致死因素。腦惡性腫瘤缺失基因1(deleted in malignant brain tumors 1，DMBT1)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種侯選的抑癌基因，它的突變失活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系［1］。CD44v6是一種重要的細(xì)胞粘附分子，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌中DMBT1、CD44v6的表達(dá)，探討DMBT1、CD44v6與食管鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為的關(guān)系，報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料隨機(jī)選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科2004年7月至2005年1月經(jīng)手術(shù)切除的食管癌標(biāo)本70例，其中男37例，女33例;年齡35～78歲，平均年齡(60±7)歲。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放療化療及免疫治療。全部病例均經(jīng)病理醫(yī)師檢查證實(shí)為食管鱗狀細(xì)胞癌，并由兩位年資較高的病理科醫(yī)生，根據(jù)1990年WHO食管癌的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將70例食管鱗狀細(xì)胞癌分為高、中、低分化三級(jí)，其中高分化鱗癌2例，中分化鱗癌29例，低分化鱗癌15例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例;侵及肌層的鱗癌14例侵及外膜層的鱗癌56例。同時(shí)取距腫瘤≥5 cm的正常食管黏膜組織23例作對(duì)照。術(shù)后立即取材，以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚4 μm，共3張，用于常規(guī)HE染色并行組化檢測(cè)。

1.2試劑第一抗體DMBT1(H-130) sc-28239兔多克隆抗體由美國(guó)Santa Cruz公司出品，CD44v6單克隆抗體和SP-900通用型工作試劑盒均購(gòu)買(mǎi)于北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3染色方法采用免疫組織化學(xué)S-P法。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，用3%過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，微波爐抗原修復(fù)。組化染色按S-P試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用已知陽(yáng)性切片作對(duì)照，用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判斷根據(jù)參考文獻(xiàn)［2］的方法，DMBT1以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒判斷為陽(yáng)性，對(duì)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共計(jì)1 000個(gè)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞并計(jì)算其所占比例:陽(yáng)性細(xì)胞＜5%，判定為陰性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞≥5%，判定為陽(yáng)性表達(dá)。根據(jù)參考文獻(xiàn)［3］的方法，CD44v6以細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞＜10%，判定為陰性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞≥10%，判定為陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖1、2。

圖1　DMBT1蛋白在高分化鱗癌中的表達(dá)，陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞漿，角化珠著色明顯(SP法×200)

圖2　CD44v6蛋白在高分化鱗癌中的表達(dá)，陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞膜(SP法×200)

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1DMBT1、CD44v6在食管黏膜上皮及癌組織的表達(dá)DMBT1、CD44v6在23例正常食管鱗狀上皮組織中表達(dá)強(qiáng)，在癌組織中表達(dá)弱或不表達(dá)。

2.2食管鱗狀細(xì)胞癌組織中DMBT1的表達(dá)與病理特征的關(guān)系DMBT1在癌組織中的表達(dá)明顯低于在正常食管鱗狀上皮組織中的表達(dá)，隨著分化程度的降低，DMBT1蛋白的表達(dá)減弱或不表達(dá)(P<0.05)，且DMBT1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，而與浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.3食管鱗狀細(xì)胞癌組織中CD44v6的表達(dá)與病理特征的關(guān)系CD44v6蛋白的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與食管鱗狀細(xì)胞癌的分化程度、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

2.4食管鱗狀細(xì)胞癌中DMBT1與CD44v6的表達(dá)與

表1　DMBT1表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系例(%)

表2　CD44v6表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系例(%)

腫瘤的生物學(xué)行為70例食管癌中，45例CD44v6表達(dá)陽(yáng)性，25例表達(dá)陰性。CD44v6陽(yáng)性組中DMBT1陽(yáng)性20例，CD44v6陰性組中DMBT1陽(yáng)性10例CD44v6陽(yáng)性組中DMBT1陽(yáng)性表達(dá)率與CD44v6陰性組中DMBT1陽(yáng)性表達(dá)率差別無(wú)顯著意義(χ2=0.13 P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表3　DMBT1和CD44v6聯(lián)合表達(dá)與食管鱗癌的關(guān)系　例

3　討論

DMBT1位于人類(lèi)染色體10q26.13，為近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種候選的抑癌基因，它的表達(dá)下調(diào)、缺失、突變失活與多種腫瘤，特別是與上皮細(xì)胞腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度存在明顯的相關(guān)性［1］。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)70例食管癌組織和23例正常食管黏膜上皮組織中DMBT1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，DMBT1蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯低于正常組織，提示DMBT1基因的失活可能與食管鱗癌的發(fā)生有關(guān)，可能具有抑癌基因?qū)δ[瘤負(fù)性調(diào)控的作用;本研究還發(fā)現(xiàn)低分化的癌組織DMBT1的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于高分化的癌組織，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織DMBT1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，這說(shuō)明DMBT1表達(dá)的減弱與食管鱗癌分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度都是影響腫瘤預(yù)后的因素，因此提示DMBT1在食管鱗癌中可能具有判斷預(yù)后的價(jià)值。

腫瘤轉(zhuǎn)移作為一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程，不僅與多個(gè)癌基因與抑癌基因的改變有關(guān)，還與腫瘤細(xì)胞的粘附性有關(guān)，CD44s是一種細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白粘附分子，其細(xì)胞膜區(qū)羧基端通過(guò)錨蛋白、埃茲蛋白、膜突蛋白、根蛋白與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白相連［4］，細(xì)胞膜外區(qū)有透明質(zhì)酸、膠原、纖維連接素、硫酸軟骨素的結(jié)合點(diǎn)［5］，CD44s通過(guò)細(xì)胞膜外受體與相應(yīng)配體的結(jié)合參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間特異性粘附過(guò)程，另外它還參與淋巴細(xì)胞歸巢，參與淋巴細(xì)胞的激活，以及參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能［6，7］。CD44v6的結(jié)構(gòu)與CD44s的基本結(jié)構(gòu)相似，但在細(xì)胞膜外靠近細(xì)胞膜區(qū)插入了43個(gè)由v6變異拼接型外顯子所編碼的不同序列的氨基酸［8］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)CD44與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果表明CD44v6蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯低于正常組織，說(shuō)明CD44v6表達(dá)下降在食管磷癌的發(fā)生中可能有一定的作用;本研究還發(fā)現(xiàn)伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織CD44v6蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，說(shuō)明CD44v6表達(dá)的減弱與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

機(jī)體免疫監(jiān)視系統(tǒng)對(duì)控制腫瘤發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵作用，進(jìn)入循環(huán)的腫瘤細(xì)胞必須逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視殺傷系統(tǒng)，才能得以在繼發(fā)器官定位生長(zhǎng)。DMBT1編碼蛋白是SRCR超家族中的新成員，SRCR超家族是免疫球蛋白超家族中具有回憶功能且大多數(shù)與免疫系統(tǒng)的增生和分化相關(guān)的家族［9－11］。DMBT1SAG(salivary agglutinin)、DMBT1GP340(glycoprotein-340)二者都是DMBT1的剪接形式［12］，分別存在于口腔、呼吸道中，與免疫防御、上皮再生有關(guān)。Mollenhauer等［13］研究發(fā)現(xiàn)，DMBT1GP340通過(guò)與肺泡表面活性蛋白Sp-D (surfactant protein D)、Sp-A作用可刺激肺泡巨噬細(xì)胞的遷移。Sp-D、Sp-A已從人類(lèi)支氣管肺泡灌洗液中分離，存在于肺泡巨噬細(xì)胞，可誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞的活化。本研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是正常食管粘膜組織還是食管鱗癌組織，其間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞DMBT1的表達(dá)均為強(qiáng)陽(yáng)性，而CD44v6有參與淋巴細(xì)胞的歸巢和參與淋巴細(xì)胞的激活的作用［6，7］，但DMBT1和CD44v6在免疫系統(tǒng)中的作用是否具有相關(guān)性還不明確。

與DMBT1相同基因的選擇性拼接的兔的hensi蛋白，能夠誘導(dǎo)微絨毛蛋白的表達(dá)，而導(dǎo)致尖端終端網(wǎng)狀蛋白(細(xì)胞角蛋白19和肌動(dòng)蛋白)的出現(xiàn)［14］CD44s細(xì)胞膜區(qū)羧基端通過(guò)錨蛋白、埃茲蛋白、膜突蛋白、根蛋白與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白相連［4］，但DMBT1蛋白與CD44v6的關(guān)系還不明確。目前也沒(méi)有DMBT 和CD44v6相互關(guān)系的報(bào)道，本研究中雖然DMBT1和CD44v6的表達(dá)并無(wú)相關(guān)性，但都與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此DMBT1和CD44v6可共同作為判斷食管鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的指標(biāo)。

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Expression and biological significance of DMBT1，CD44v6 in esophageal squamous cell carcinoma

LUO Wenyan*， CHENG Yuan*，HU Aiyuan，et al.*
Department of Pathology，College of Basic Medicine of Hebei TCM College，Shijiazhuang 050200，China

【Abstract】Objective To investigate the expression of DMBT1，CD44v6 in esophageal squamous cell carcinoma，and to explore the correlation between their expressions and the biological behavior of tumors.Methods The expression levels of DMBT1 and CD44v6 were detected by immunohistochemistry (IHC) in 70 cases of esophageal squamous cell carcinoma and 23 cases of incisal margin normal tissues.Results The expression levels of DMBT1 and CD44v6 in esophageal squamous cell carcinoma were decreased or negative.The expression levels of DMBT1 were related with histological differentiation degree，lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma (P<0.05)，however，which were not associated with infiltration depth of tumor tissues (P＞0.05).The expression levels of CD44v6 were correlated to lymph node metastasis (P ＜0.05)，however，which were not related with histological differentiation degree and infiltration depth of tumor tissues (P＞0.05).ConclusionThe decrease of DMBT1expression may be the biological markers of poor differentiation and higher malignancy degree of esophageal squamous cell carcinoma tissue，moreover，which is closely correlated to lymph node metastasis of tumor.The expression levels of CD44v6 are related with the pathogenesis and lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma.

【Key words】esophageal squamous cell carcinoma; DMBT; CD44v6; immunohistochemistry

(收稿日期:2014－10－27

通訊作者:左連富，050051河北醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.002

【文章編號(hào)】1002－7386(2015) 09－1290－03

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 735.1