李新源　郭亞民　吳新民　王皓

作者單位: 810000西寧市，青海大學研究生院(李新源) ;青海省人民醫(yī)院普外科(郭亞民、吳新民、王皓)

大鼠急性胰腺炎Caspase-3及Survivin在胰腺組織中表達的實驗研究

李新源郭亞民吳新民王皓

作者單位: 810000西寧市，青海大學研究生院(李新源) ;青海省人民醫(yī)院普外科(郭亞民、吳新民、王皓)

【摘要】目的檢測Caspase-3及Survivin在急性胰腺炎大鼠胰腺組織中的表達并探討其與胰腺組織損傷的關系。方法60只SPF級雄性Wistar大鼠隨機分為假手術組、胰腺炎6 h組、胰腺炎12 h組及胰腺炎24 h組。采用胰腺被膜下注射牛磺膽酸鈉(Na-Tc)建立急性胰腺炎模型。分別檢測4組大鼠血清淀粉酶(AMY)、胰腺病理損傷、胰腺組織中Caspase-3及Survivin的表達程度。結果假手術組、胰腺炎6 h、12 h、24 h組組間兩兩比較血清淀粉酶及胰腺組織病理評分胰腺組織Caspase-3及Survivin平均光密度表達差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Caspase-3、Survivin、血清淀粉酶及胰腺病理評分均有相關性(P<0.05)。結論急性胰腺炎過程中伴隨著Caspase-3及Survivin的表達紊亂，并且與胰腺損傷密切相關。

【關鍵詞】胰腺炎，急性; Caspase-3; Survivin;大鼠

E-mail: gym135@ yeah.net

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種臨床常見的、兇險的急腹癥之一，其發(fā)展迅速、病情危重，?？沙霈F(xiàn)全身炎性反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)導致患者死亡［1］。其中Caspase-3及Survivin在AP時通過調控患者外周血中性粒細胞的凋亡延遲作用參與調節(jié)AP進程中胰腺腺泡細胞的凋亡，使損傷的胰腺細胞由凋亡轉為壞死，進而加重AP病情進展。白細胞過度激活-多種炎性因子和介質級聯(lián)瀑布反應、胰腺微循環(huán)障礙學說均認為在SAP疾病中存在，這更加重胰腺微循環(huán)障礙，并與SIRS、MODS密切相關而相關，對微循環(huán)障礙的治療及抗凝血系統(tǒng)治療也是有效的。本實驗通過檢測Caspase-3及Survivin在AP胰腺組織中的表達，從而探討二者與胰腺組織損傷的關系。

1　材料與方法

1.1材料及分組選用健康雄性SPF級Wistar大鼠共60只［由甘肅省中醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物許可證號: SCXK(甘) 2009-0004］，體重180～240 g，隨機分成4組:假手術組、胰腺炎6 h組、胰腺炎12 h組胰腺炎24 h組，每組15只。

1.2動物模型的制備采用胰腺被膜下注射5%牛磺膽酸鈉(Na-Tc)制備AP的方法。大鼠術前禁食12 h，不禁水。用25%烏拉坦按4 ml/kg做腹腔內注射麻醉。胰腺炎組按1 ml/kg胰腺被膜下注入5%?；悄懰徕c，假手術組僅作剖腹術，輕翻動胰腺組織，術后禁食，不禁水。

1.3標本采集假手術組在6 h時處死，胰腺炎組在造模后6 h、12 h、24 h 3個時點分批解剖大鼠，觀察胰腺大體病理變化。由腹主動脈采血3 ml，注入密封促凝采血管中靜置1 h后以3 000 r/min低溫離心10 min，分離血清(用于淀粉酶測定)。取部分胰腺組織浸泡在10%甲醛液后備用(用于胰腺組織病理評分及Caspase-3、Survivin免疫組化測定)。

1.4檢測儀器及試劑血清淀粉酶檢測采用日本Sysmex株式會社CHEMIX-800全自動生化分析儀。取出的胰腺組織做HE染色及免疫組化。免疫組化Caspase-3、Survivin一抗、二抗試劑均購買于北京博奧森生物技術有限公司，一抗稀釋比1∶500，測定平均光密度的軟件為Image-Pro Plus 6.0，每個胰腺組織切片隨機選取4個圖像進行光密度測定。

1.5統(tǒng)計學分析應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用one-way ANOVA，并用S-N-K進行兩兩比較，相關關系采用Pearson相關分析，進行雙側檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1胰腺組織病理評分(histopathologic scores，HS)及血清淀粉酶胰腺病理評分采用Grewal改良評分標準［2］隨即采取四個視野，從水腫、壞死、炎癥、出血4個方面進行評分:假手術組、胰腺炎6 h、12 h、24 h組組間兩兩比較胰腺組織病理評分差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。假手術組、胰腺炎6 h、12 h、24 h組組間兩兩比較血清淀粉酶差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、2，圖1～4。

表1　AP胰腺病變嚴重程度評分標準(改良Grewal法)

表2　血清淀粉酶及HE染色胰腺病理評分比較n=15，±s

表2　血清淀粉酶及HE染色胰腺病理評分比較n=15，±s

注:與假手術組比較，*P＜0.05;與胰腺炎6 h組比較，#P＜0.05;與胰腺炎12 h組比較，△P＜0.05

指標　假手術組　胰腺炎6 h組　胰腺炎12 h組　胰腺炎24 h組　F值　P值血清淀粉酶(U/L)　981±311　2 668±481*　3 667±459* #　6 593±312* #△537.19＜0.05 HE病理評分(分) 1.03±0.48 3.03±0.74*　5.90±0.80* #　9.76±0.77* #△423.59＜0.05

圖1　假手術組胰腺組織(HE ×200)

圖2　胰腺炎6 h組胰腺組織(HE ×200)

圖3　胰腺炎12 h組胰腺組織(HE×200)

圖4　胰腺炎24 h組胰腺組織(HE×200)

2.2大鼠胰腺中Caspase3及Survivin的表達假手術組、胰腺炎6 h、12 h、24 h組組間兩兩比較胰腺組Caspase3平均光密度差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。假手術組、胰腺炎6 h、12 h、24 h組組間兩兩比較胰腺組Survivin平均光密度差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3，圖5～12。

2.3Caspase-3、Survivin、血清淀粉酶及HE染色胰腺病理評分相關關系Caspase-3與Survivin呈負相關(r=－0.686，P＜0.05)，Caspase-3與血清淀粉酶呈負相關(r=－0.800，P＜0.05)，Caspase-3與病理評分呈負相關(r=－0.802，P＜0.05)，Survivin與血清

表3　胰腺炎大鼠不同組別Caspase3、Survivin平均光密度比較　n=15，±s

表3　胰腺炎大鼠不同組別Caspase3、Survivin平均光密度比較　n=15，±s

注:與假手術組比較，*P＜0.05;與胰腺炎6 h組比較，#P＜0.05;與胰腺炎12 h組比較，△P＜0.05

指標　假手術組　胰腺炎6 h組　胰腺炎12 h組　胰腺炎24 h組　F值　P值胰腺組織Caspase-3平均光密度　0.500±0.056　0.442±0.058*　0.370±0.059* #　0.283±0.052* #△165.08?。?.05胰腺組織Survivin平均光密度　0.300±0.044　0.399±0.056*　0.481±0.056* #　0.544±0.057* #△230.24?。?.05

圖5　假手術組胰腺Caspase-3(免疫組化×200)

圖6　胰腺炎6 h組胰腺Caspase-3(免疫組化×200)

圖7　胰腺炎12 h組胰腺Caspase-3(免疫組化× 200)

圖8　胰腺炎24 h組胰腺Caspase-3(免疫組化× 200)

圖9　假手術組胰腺Survivin(免疫組化×200)

圖10　胰腺炎6 h組胰腺Survivin(免疫組化×200)

圖11　胰腺炎12 h組胰腺Survivin(免疫組化×200)

圖12　胰腺炎24 h組胰腺Survivin(免疫組化×200)

淀粉酶呈正相關(r=0.811，P＜0.05)，Survivin與病理評分呈正相關(r=0.821，P＜0.05)，血清淀粉酶與病理評分呈正相關(r=0.950，P＜0.05)。見表4。

表4　Pearson相關分析

3　討論

AP是一種并發(fā)癥多而嚴重，臨床治療棘手，病死率高，恢復時間較長的疾病。其發(fā)病機制是一個多因素參與的復雜的病理生理過程，在目前國內外諸多學者探討并提出與AP的發(fā)病機制相關學說有: (1)胰酶自身消化學說:是AP最基本的發(fā)病機制學說。正常情況下，胰腺分泌合成的胰酶以無活性的酶原形式存在，當發(fā)生胰管梗阻、十二指腸液或膽汁反流等時，導致胰蛋白酶在胰腺內被異位激活，活化的胰蛋白酶進而激活其他蛋白酶，引起胰腺自身消化，是重癥AP患者發(fā)生多器官損害的重要病理生理基礎。(2)炎性因子學說:該學說闡述AP的發(fā)病機制也被廣泛接受。AP是一種局部或全身性的炎性反應，胰腺炎早期，IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)等細胞因子觸發(fā)炎癥，更多的炎性因子發(fā)生瀑布樣級聯(lián)反應，導致全SIRS、MODS。 (3)細胞凋亡學說:胰腺腺泡細胞對損傷的反應在AP的發(fā)病過程中起關鍵作用。輕癥AP時，大量胰腺腺泡細胞發(fā)生凋亡;而重癥AP時，胰腺腺泡細胞發(fā)生明顯壞死，但只有少量細胞發(fā)生凋亡。因此，胰腺腺泡細胞凋亡與疾病嚴重程度呈顯著負相關，胰腺腺泡細胞通過凋亡阻止疾病進一步進展為重癥AP。近年來，凋亡抑制蛋白在胰腺炎中的作用成為研究熱點。(4)腸道細菌易位學說:正常情況下，腸道細菌不易突破腸黏膜的屏障進入腸外組織。發(fā)生AP時，腸黏膜通透性增加，腸道細菌過度生長，導致腸道菌群進入腹腔，經(jīng)膽管、胰膽管逆行感染，刺激活化的巨噬細胞產生大量炎性因子，進一步損害胰腺。(5)其他學說:包括氧化應激學說、腺泡內鈣超載學說等等。研究發(fā)現(xiàn)，在AP時胰腺腺泡細胞對損傷的反應在整個發(fā)病過程中起著關鍵的作用，誘導和抑制胰腺腺泡細胞凋亡可影響AP的嚴重程度和改變疾病的轉歸［3］。在AP的發(fā)病過程中，細胞凋亡、細胞因子、炎性介質等因素均起著舉足輕重的作用，例如Fas、TNF-α、IL-1、NF-κB和IL-18等均參與了AP的發(fā)病機制和病理生理過程，然而Caspase對上述物質在凋亡信號轉導和炎性反應過程中具有重要的調控作用，Survivin則是一種凋亡抑制基因，具有調節(jié)細胞周期等多種生物活性的作用。

Caspases是一組存在于胞質溶膠中的結構上相關的半胱氨酸蛋白酶，它們的一個重要共同點是具有特異地斷開天冬氨酸殘基后肽鍵的功能。Caspases主要行使兩類功能:誘導凋亡和參與炎性反應。其中Caspase-2、3、6、7、8、9和10主要參與凋亡信號轉導，其他一些Caspases則主要參與細胞因子的激活和炎性反應。其中Caspase-3在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮著重要功能。Caspase-3正常以酶原(32 kD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基(17 kD)和兩個小亞基(12 kD)組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。本實驗結果提示Caspase-3蛋白廣泛表達于正常胰腺腺泡細胞、胰腺導管上皮細胞及部分胰腺間質浸潤的炎性細胞，胞漿分布，呈棕黃色細顆粒狀，并且隨著AP病情的加重，Caspase-3表達逐漸減弱，胰腺細胞組織凋亡系統(tǒng)功能減弱，從而導致未凋亡的細胞逐漸增多，致炎因子逐漸增加［4］。大量的炎性因子誘導發(fā)生大量的級聯(lián)瀑布反應，導致機體出現(xiàn)全身SIRS，最終病情逐漸加重，出現(xiàn)MODS。

Survivin是一種凋亡抑制基因，是迄今發(fā)現(xiàn)分子量最小、作用最強的凋亡抑制因子之一，位于染色體17q25上，其編碼的Survivin蛋白是由142個氨基酸組成，分子量為16.5 kD的蛋白質，以同源二聚體的形式存在，表達于細胞周期的G2/M期。Survivin僅表達于胚胎組織、發(fā)育中的胎兒組織、胸腺和生殖腺，而在分化成熟的成人胰腺組織中不表達或低表達。Survivin的生物學功能主要是通過抑制凋亡通路下游的Caspase-3、Caspase-7從而對抗Fas、Bax、細胞色素和Caspase誘導的凋亡，對抗G2/M期細胞凋亡的誘導，Survivin可通過抑制炎性細胞的凋亡而在炎癥中發(fā)揮作用。因此，Survivin的異常升高可以直接加機體炎癥的級聯(lián)反應，使AP病情惡化［5］。有研究表明Survivin是評估疾病預后的獨立預測因子，Survivin過表達越高，提示疾病預后越差［5］。本實驗結果顯示在正常胰腺組織見Survivin蛋白弱表達，腺泡細胞凋亡率很低。建立AP模型后Survivin蛋白廣泛表達于胰腺腺泡細胞、胰腺導管上皮細胞及部分胰腺間質浸潤的炎性細胞，胞漿分布，呈棕黃色細顆粒狀，在炎癥浸潤區(qū)及腺泡細胞壞死區(qū)表達稍高。在炎癥程度較輕的AP6 h組Survivin呈弱表達，腺泡細胞凋亡率較高。隨胰腺炎癥程度的加重，Survivin蛋白的表達水平逐漸升高，而腺泡細胞凋亡率則逐漸下降。提示Survivin蛋白表達與胰腺壞死呈正相關，可能是預測AP嚴重程度的一個重要指標。這一結果可能說明Survivin蛋白在AP病程中不僅使激化的致炎癥細胞存活，加重機體炎性反應，而且通過其抗凋亡作用使受炎癥損傷的胰腺組織細胞由凋亡轉為壞死，從而促使細胞內胰酶外溢釋放，加重AP病情。

多種因素導致的機體凋亡與抗凋亡機制失調，引發(fā)AP病情加劇，其中包括Caspases家族及Survivin凋亡抑制蛋白家族的改變。凋亡紊亂的程度與AP繼發(fā)ARDS和MODS密切相關。作為Caspases家族及凋亡抑制蛋白家族的代表，Caspase-3與Survivin在各自的家族中具有重要意義。測定Caspase-3與Survivin在評估AP的進展及嚴重度上被證明有用，動態(tài)檢測上述指標，有助于預測AP的嚴重程度和轉歸。因此，對AP的治療應在積極治療胰腺炎本身及病因治療的同時，改善局部凋亡紊亂、減少局部炎性因子的紊亂有助于減少AP疾病進一步惡化的程度及病死率。

AP是由多種因素共同參與的病理生理過程，各因素之間既相互獨立又相互制約，共同影響疾病的發(fā)生轉歸。基于上述發(fā)病機制，衍生出眾多新的治療方案如應用細胞因子抗體及拮抗劑，構建各種載體基因治療以及早期應用血管活性藥物及微循環(huán)保護劑、抗氧化劑和氧自由基清除劑、擴容等手段，抑制或誘導細胞凋亡，改善機體微循環(huán)，去除機體游離氧自由基，從而改善AP患者預后及轉歸［6，7］。本實驗說明: (1) AP病程中細胞凋亡紊亂的程度是隨著病情的發(fā)展而逐漸加重的; (2) AP病情嚴重程度與Caspase-3、Survivin指標變化有著密切的關系。因此，測定Caspase-3與Sur vivin具有重要的臨床意義，可以深入研究AP病變發(fā)生發(fā)展中的啟動因子和惡化因子，以及它們之間的相互影響和制約關系，這對于AP的治療有著深遠的意義。

參考文獻

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Experimental study on the expression of Caspase-3 and Survivin in rats with acute pancreatitis

LI Xinyuan*，GUO Yamin，WU Xinmin，et al.*
Graduate School of Qinghai University，Qinghai，Xining 810000，China

【Abstract】Objective To detect the expression levels of Caspase-3 and Survivin in rats with acute pancreatitis，and to explore their correlation with pancreatic tissue damage.Methods Sixty SPF male Wistar rats were randomly divided into four groups: sham-operation group (n=15)，6 hours after pancreatitis group (6h group，n=15)，12 hours after pancreatitis group (12h group，n=15)，24 hours after pancreatitis group (24h group，n=15).The animal models with pancreatitis were induced by injection of 5% Na-Tc under capsula pancreatis.The activity of serum amylase，pathological injury of pancreas，expression levels of Caspase-3 and Survivin were detected for all the groups.Results There were significant differences in the activity of serum amylase，pathological injury of pancreas and the expression levels of Caspase-3 and Survivin among sham-operation group，6h group，12h group，24h group with each other (P<0.05).There were close correlations among Caspase-3，Survivin，serum amylase and pathological injury scoring.ConclusionThe process of acute pancreatitis is accompanied with the expression disorder of Caspase-3 and Survivin，furthermore，which is closely correlated to pancreas injury.

【Key words】acute pancreatic; Caspase-3; Survivin; rats

(收稿日期:2014－12－23

通訊作者:郭亞民，810007西寧市，青海省人民醫(yī)院普外科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.003

【文章編號】1002－7386(2015) 09－1293－04

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 576.1