滿一　鐘良軍　徐巍巍

作者單位: 065000河北省廊坊市，中國石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院口腔科(滿一、徐巍巍) ;杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系(鐘良軍)

口腔黏膜白斑凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)及意義

滿一鐘良軍徐巍巍

作者單位: 065000河北省廊坊市，中國石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院口腔科(滿一、徐巍巍) ;杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系(鐘良軍)

【摘要】目的通過探討凋亡相關(guān)蛋白在口腔白斑病變過程中細(xì)胞凋亡狀況和凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)的研究，探討白斑發(fā)病機(jī)制及惡變機(jī)理。方法采用免疫組織化學(xué)檢測法，與正常口腔粘膜對照，觀察分析29例口腔白斑中Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果上皮異常增生各組的凋亡指數(shù)均高于正常，Bcl-2、Bax在上皮單純增生、異常增生顯過度表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度、分布也發(fā)生了改變。結(jié)論癌前病變中，上皮細(xì)胞凋亡狀況發(fā)生了改變，Bcl-2可能對增生組織向惡變的轉(zhuǎn)化發(fā)揮階段性的促進(jìn)作用，促凋亡因子Bax作用加強(qiáng);凋亡因子的發(fā)揮即相互協(xié)同又相互制約。

【關(guān)鍵詞】白斑;凋亡蛋白; Bcl-2; Bax

口腔黏膜白斑是最常見癌前病損，處于向惡性轉(zhuǎn)化的不穩(wěn)定狀態(tài)，以不同程度的上皮增殖和不典型上皮增生為基本特征，在細(xì)胞異常增殖中，凋亡相關(guān)蛋白都有質(zhì)與量的變化。為此，在正?？谇火つど掀は蛏掀ぎ惓Ｔ錾D(zhuǎn)化的不同階段，觀察和探討細(xì)胞凋亡生物學(xué)行為對上皮增殖影響，不僅有助于闡明惡變發(fā)生的機(jī)制，而且有利于臨床上篩選高危人群和評估白斑的預(yù)后和治療效果。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇中國石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院2009年7月至2012年12月經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的正?？谇火つ?5例，白斑29例，其中單純上皮增生9例、輕度異常增生6例，中度輕度異常增生8例，重度異常增生6例。所有檢材診斷和組織學(xué)分類均依據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，由兩名經(jīng)驗豐富的病理學(xué)專家完成。

1.2試劑所有試劑均購至福州邁新生物技術(shù)有限公司。Bcl-2、Bax為即用型鼠抗人單克隆抗體，SP復(fù)合物MaxVisionTM為快捷即用型是通過聚合物技術(shù)把過氧化物酶與抗鼠和抗兔IgG分子結(jié)合在多聚物上形成多聚物分子，使酶分子與二抗直接結(jié)合形成的多聚物分子高度敏感性染色強(qiáng)度增大，避免非特異性背景染色。DAB顯色試劑盒為鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(HPR)免疫組化染色Enivision系統(tǒng)，適用于鏈霉素-過氧化物酶免疫組織化學(xué)染色方法(streptavidin peroxidase，SP)。

1.3實驗方法采用免疫組化鏈霉素抗生素-過氧化物酶免疫組織化學(xué)染色方法(streptavidin-peroxidase SP)法染色檢測細(xì)胞凋亡與增值狀況。所有組織切片經(jīng)10%甲醛固定、常規(guī)脫蠟、透明、浸蠟、石蠟包埋5 μm連續(xù)切片，固定于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，常規(guī)組織切片脫蠟入水;微波加熱10 min暴露抗原;過氧化物酶溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性PBS水沖洗，鼠抗人即用型Bcl-2和Bax抗體37℃孵育60 min，加入SP復(fù)合物HRP-MarVisionTM，30℃孵育60 min;加入SP復(fù)合物HPR，4℃過夜; DAB緩沖液、DAB底物、DAB色原順序加入、混勻成DAB顯色液滴定組織切片，室溫下顯色10 min，顯色后蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，封片。以PBS代替一抗為陰性對照，以組織內(nèi)淋巴細(xì)胞陽性染色為Bcl-2的陽性對照，胃癌陽性染色切片為Bax的陽性對照(福州邁新生物技術(shù)公司提供)。

1.4結(jié)果判定采用HM2A8-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，每例每張切片各隨機(jī)選取5個不重復(fù)、不重疊200和400倍高清視野，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染成棕色或棕紅色顆?；驈浡善瑺顬锽cl-2和Bax的陽性表達(dá)。計數(shù)切片中1 000個上皮基底細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)。參照Hueber等［1］標(biāo)準(zhǔn)，將Bcl-2和Bax定級為: (1) bcl-2，未見陽性細(xì)胞著色為陰性(－) ;陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為(+) ; 11%～25%為(++) ; 26%～50%為(+++) ;＞50%為(++++)。(2) Bax，陽性反應(yīng)為棕色到棕紅色顆?；蚱瑺顝浬⒍ㄎ挥诎麧{，高倍鏡下計數(shù):標(biāo)本中無陽性細(xì)胞為0分，＜25%為1分; 26～50%為2分; 50%以上為3分，最后求其平均數(shù)。染色強(qiáng)度以棕色為1分;深棕色為2分;棕紅色為3分。兩者相乘，0分為陰性(－) ; 1～3分為弱陽性(+) ; 4～6分為中等陽性(++) ; 7～9分為(+++)。計算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)(×200)×100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，病變組織與對照組中陽性表達(dá)率以及各種臨床指標(biāo)中的表達(dá)率的的的差異采用χ2檢驗;樣本數(shù)＜40，癌前病變Bcl-2、Bax陽性表達(dá)率之間的相關(guān)性，白斑與正常上皮之間的bcl-2、bax陽性表達(dá)率的差異采用Fisher精確概率法單因素相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1口腔白斑皮損組織Bcl-2蛋白免疫組化染色白斑各組的凋亡指數(shù)均高于正常口腔黏膜，并與鱗癌的凋亡指數(shù)接近［2］。在25例正常口腔黏膜中出現(xiàn)例Bcl-2陽性著色，主要分布在上皮基底及棘層。2例白斑中15例出現(xiàn)染色強(qiáng)度各異的陽性著色，陽性率51.72%，病變各組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，主要定位于細(xì)胞核周。另外，白斑各組中Bcl-2陽性細(xì)胞分布也發(fā)生改變，強(qiáng)陽性反應(yīng)細(xì)胞大多集中于基底層與棘層深層，常見彌漫上皮全層的陽性染色，與內(nèi)對照的陽性淋巴細(xì)胞相比，反應(yīng)強(qiáng)度要弱，由基底向上皮表層過渡層染色強(qiáng)度不變，在病理分級中白斑各階段陽性細(xì)胞表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。Bcl-2在上皮細(xì)胞表達(dá)分布主要有兩種形式:其一局灶型，以數(shù)個、數(shù)十個Bcl-2陽性細(xì)胞聚集成團(tuán)狀;其二彌散型，但染色強(qiáng)度未減弱，與內(nèi)對照淋巴細(xì)胞相比，上皮細(xì)胞染色弱。見表1、2，圖1～4。

表1　口腔正常黏膜、白斑、扁平苔蘚上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)比較

2.2口腔白斑皮損組織Bax蛋白免疫組化染色在25例正?？谇火つぶ谐霈F(xiàn)10例Bax陽性著色，主要分布在角化層和粒層，點狀散在型分布為主，表達(dá)程度較均一，為弱陽性反應(yīng)。29例白斑中22例出現(xiàn)Ba陽性著色，陽性率75.86%，與正常組織相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。主要定位于細(xì)胞胞質(zhì)中基底層以上到角化層均有表達(dá)，部分基底層也見陽性反應(yīng)，棘層的染色最強(qiáng)，強(qiáng)陽性著色細(xì)胞遍布棘細(xì)胞全層與胞外基質(zhì)。中等強(qiáng)度以上的染色達(dá)60%以上，隨上皮異常增生程度的加劇，Bax的表達(dá)逐步增強(qiáng)，重度異常增生達(dá)最高，多數(shù)彌散型分布。見表2，圖5～8。

表2　Bcl-2、Bax蛋白在口腔正常黏膜、白斑病損區(qū)的表達(dá)　例

3　討論

對Bcl-2蛋白的表達(dá)，數(shù)量有限的報道結(jié)果并不一致，Renata等［3］對胎兒、新生兒和成人皮膚組織的研究中發(fā)現(xiàn)Bcl-2僅局限于基底細(xì)胞。Dekker等［4］的結(jié)果也認(rèn)為Bcl-2可能只是作為基底干細(xì)胞的一種標(biāo)志。本研究系統(tǒng)地觀察了由健康口腔黏膜轉(zhuǎn)化為重度上皮異常增生的過程細(xì)胞凋亡狀況，結(jié)果表明上皮中均有Bcl-2的表達(dá)，是一種普遍現(xiàn)象，只是在其表達(dá)程度、表達(dá)強(qiáng)度、陽性細(xì)胞分布發(fā)生了改變。Bcl-2敲除(kick out)實驗證實，新生的小鼠在Bcl-2基因剔除幾周后，大部分死亡，小鼠腎內(nèi)細(xì)胞凋亡增多，腎單位減少［4］。結(jié)合Bcl-2陽性細(xì)胞在上皮中的表達(dá)部位，提示生理狀況下Bcl-2正常分泌是細(xì)胞周期連續(xù)運轉(zhuǎn)及細(xì)胞數(shù)量的相對穩(wěn)定的需要，是細(xì)胞周期運行的驅(qū)動力之一。Bcl-2表達(dá)有利于順利通過G2/M周期調(diào)控點，觸發(fā)有絲分裂，缺乏Bcl-2表達(dá)則休眠期細(xì)胞增多，許多細(xì)胞將暫時或永久退出細(xì)胞周期。但當(dāng)細(xì)胞周期完成即將通過凋亡而發(fā)生克隆消失時，Bcl-2的表達(dá)則應(yīng)下調(diào)［5］。

圖1　正常口腔黏膜上皮Bcl-2表達(dá)與分布(SP×400)

圖2　Bcl-2在中度異常增生中的表達(dá)(SP×400)

圖3　Bcl-2在重度異常增生中的表達(dá)(SP×400)

圖4　重度異常增生中Bcl-2的表達(dá)與分布(SP×400)

圖5　正?？谇火つど掀ax的表達(dá)(SP×400)

圖6　單純上皮增生Bax的表達(dá)(SP×400)

圖7　Bax在上皮異常增生的過度表達(dá)(SP×400)

圖8　Bax在上皮異常增生的過度表達(dá)(SP×400)

研究顯示，由正?？谇簧掀は虍惓Ｔ錾D(zhuǎn)化后Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯升高。細(xì)胞異型性分級升高，Bcl-2陽性細(xì)胞比例也隨之增大，中度異常上皮增生達(dá)最高，與細(xì)胞增殖活性的增加基本成正比關(guān)系，而在重度異常增生階段則有所下降。我們認(rèn)為細(xì)胞凋亡與增殖相輔相承，其增殖與程序性死亡速度的平衡才是決定白斑等癌前病變最終細(xì)胞表型的關(guān)鍵?？沟蛲龅鞍譈cl-2代償性增高時，分裂活躍的幼稚型細(xì)胞通過選擇最終獲得了生存優(yōu)勢，尤其是基因水平上能抵抗細(xì)胞凋亡具有突變表型的細(xì)胞增殖優(yōu)勢得到加強(qiáng)細(xì)胞凋亡減少，增殖細(xì)胞絕對凋亡率的降低，細(xì)胞個體壽命延長，“凋亡細(xì)胞”的繼續(xù)生存直接影響細(xì)胞數(shù)量增加，獲得基因繼發(fā)突變的機(jī)會增加，這是腫瘤形成的一個重要基礎(chǔ)，另外Bcl-2過表達(dá)可以阻斷損傷感受器與細(xì)胞凋亡之間的信號傳導(dǎo)途徑，增強(qiáng)對其它癌基因的易感性。與正常上皮相比，本研究中異常增生上皮Bcl-2蛋白的強(qiáng)陽性表達(dá)更多集中于基底干細(xì)胞層?；准?xì)胞是分裂最活躍的多能干細(xì)胞，具有多向分化潛能，其分化的取向決定細(xì)胞的最終表型，一個干細(xì)胞的凋亡意義遠(yuǎn)大于一個淺層分化細(xì)胞的凋亡［6］Bcl-2過表達(dá)抑制生發(fā)層中DNA損傷細(xì)胞正常凋亡而保持損傷狀態(tài)，可使此類染色體不穩(wěn)定、基因突變細(xì)胞的壽命延長，表型改變的不斷累積，將促進(jìn)惡性細(xì)胞克隆。雖然Bcl-2的表達(dá)不能直接誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，但如果合并轉(zhuǎn)入某些癌基因如c-myc，則很快誘發(fā)腫瘤發(fā)生［7］。這種誘導(dǎo)生長癌基因細(xì)胞與凋亡抑制因子的協(xié)同作用，提示細(xì)胞凋亡的抑制能夠促進(jìn)癌基因激活腫瘤細(xì)胞的存活。因此推測Bcl-2在基底層的過表達(dá)也是上皮異常增生初發(fā)癌基因事件后促惡性的轉(zhuǎn)化因素之一，誘導(dǎo)了初始基因突變后續(xù)事件的發(fā)生。

Bax蛋白是在白細(xì)胞基因文庫中發(fā)現(xiàn)的21 k Bcl-2同源蛋白，因RNA剪方式的不同編碼三種蛋白Baxα、Baxβ、Baxγ。其中Baxα為跨膜蛋白，可與Bcl 2α結(jié)合異二聚體Bcl-2/Bax，或形成同種二聚體Bax Bax，細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)嚴(yán)格依賴于二者的化學(xué)計量。

正常口腔黏膜上Bax蛋白陽性細(xì)胞多位于顆粒層，并且呈點狀散在分布，這符合黏膜上皮細(xì)胞分裂起源于基底層并逐漸向角化層移行成熟、衰老、凋亡的生理特征。而當(dāng)上皮出現(xiàn)異常增生時，Bax蛋白的表達(dá)隨著增生強(qiáng)度改變而強(qiáng)化，強(qiáng)陽性染色細(xì)胞大多集中在上皮棘層。文獻(xiàn)報道，鼻咽癌組織中的Bax蛋白表達(dá)較慢性鼻咽炎組織的免疫反應(yīng)明顯減弱，鼻咽癌中促凋亡基因受到抑制［8］。Dekker等［4］發(fā)現(xiàn)在鱗癌階段Bax蛋白表達(dá)下調(diào)。由此可見，當(dāng)增生性質(zhì)的改變時，若細(xì)胞獲得惡性表型，Bax蛋白可能失去作用或部分失去作用，腫瘤細(xì)胞自發(fā)的凋亡可能不再增加，細(xì)胞增殖加快。因此，在上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化階段，Bax蛋白表達(dá)的異常增高是白斑惡變的早期階段自我免疫反應(yīng)，體現(xiàn)了機(jī)體為抑制過度生長的細(xì)胞群體，新生細(xì)胞開始啟動了細(xì)胞自穩(wěn)定機(jī)制，試圖通過Bax/Bax蛋白表達(dá)的強(qiáng)化，促進(jìn)異常增殖細(xì)胞的凋亡，維持細(xì)胞數(shù)目的穩(wěn)定。細(xì)胞凋亡能除去一些有基因突變的細(xì)胞，阻止惡性轉(zhuǎn)錄，對腫瘤的生長產(chǎn)生副調(diào)控作用，使腫瘤發(fā)生的時間延遲。在重度異常增生階段，則是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化加速階段，通過Bax蛋白表達(dá)強(qiáng)化加速一些分裂周期短、增殖快，具有顯著惡變表型的異質(zhì)細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞獲得惡性表型，促凋亡基因受到抑制，異型細(xì)胞的凋亡受阻，可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要因素。另一方面，Bax蛋白對分裂周期長、增殖慢但具有高侵襲力、尚處在潛伏期的腫瘤細(xì)胞的免疫麻痹，喪失清除能力，維持潛在腫瘤細(xì)胞增殖率，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生存周期過長，腫瘤細(xì)胞聚集造成細(xì)胞爆發(fā)式惡變，其保留的惡性細(xì)胞具有惡性程度高、侵襲力強(qiáng)、預(yù)后差?；蚯贸龑嶒炓舱f明，細(xì)胞凋亡抑制因子如Bcl-2，可以作為癌基因，或者說使細(xì)胞凋亡的促進(jìn)因子如Bax，可以作為腫瘤抑制因子，如果敲除了具有促凋亡活性基因的大鼠腫瘤的發(fā)病率升高，則提示這個基因具有抑癌功能［9］。研究顯示Bax蛋白陽性表達(dá)率在重度異常增生階段達(dá)到最高的84%，而同一病理分期中，Bcl-2表達(dá)則有所下降，低于中度異常增生［9］，說明細(xì)胞惡轉(zhuǎn)過程中存在促凋亡與凋亡抑制的相互傾軋傾向。

關(guān)于細(xì)胞數(shù)目自穩(wěn)定啟動機(jī)制，Adams等［9］認(rèn)為除Bax、Bcl-2和Bak外，在Bcl-2凋亡蛋白家族中還有一個單BH3結(jié)構(gòu)域蛋白，單BH3結(jié)構(gòu)域蛋白Bim、Bmf能夠與線粒體膜外的抗凋亡Bcl-2家族蛋白相互作用。其活性通過轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)、翻譯后磷酸化、細(xì)胞骨架扣押等機(jī)制調(diào)節(jié)，從而結(jié)合并拮抗抗凋亡的Bcl-2家族蛋白來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10，11］，當(dāng)接到凋亡信號后，Bax與 Bak在線粒體外膜聚集，形成允許細(xì)胞色素C通過的通道。在正常細(xì)胞中，Bim、Bmf被分別扣押在微管和肌球蛋白而保持無活性狀態(tài)，caspase8可以裂解激活Bid，磷酸化可以調(diào)節(jié)Bax的活性。

本實驗對調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控蛋白進(jìn)行了研究，顯示促凋亡基因受到抑制，癌細(xì)胞的凋亡受阻，可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要因素，實際上細(xì)胞凋亡和增殖的平衡是決定細(xì)胞最終表型的重要因素。細(xì)胞惡變發(fā)生過程中存在促凋亡與凋亡抑制的相互傾軋傾向。從細(xì)胞凋亡的機(jī)制出發(fā)，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究，可以爭取癌前病變不同階段對抓住有效治療時期減少后期惡變的可能性或消除化療藥物所帶來的不良反應(yīng)，對臨床檢測疾病的轉(zhuǎn)歸，預(yù)防癌變的發(fā)生有指導(dǎo)意義。

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Expression and significance of Bcl-2 Bax in oral leukoplakia

MAN Yi*，ZHONG Liangjun，XU Weiwei*.*
Department of Stomatology，China National Petroleum Corporation Central Hospital，065000，China

【Abstract】Objective To investigate the expression and significance of apoptosis－related protein Bcl-2，Bax in oral leukoplakia (OLK)，and to explore the mechanism of pathogenesis and cancerization of oral leukoplakia.MethodsThe expression levels of Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemistry in 29 cases OLK and 25 cases of healthy oral mucosa.Results The apoptosis indexes (AI) of OLK epithelial cells in simple hyperplasia，dysplasia (mild，moderate，severe degrees ) were significantly increased，as compared with those in normal mucosa.In OLK epithelium，the overexpressions of Bcl-2，Bax in positive cells were observed，and the intensity and distribution of apoptosis-related protein were significantly changed.ConclusionIn precancerous lesions，Bcl-2 may promote the progression of canceration of hyperplastic tissue，enhance the effects of Bax in inducing cell apoptosis，moreover，the effects of apoptosis-related proteins are not only cooperative but also restrict each other.

【Key words】leukoplakia; apoptosis ptotein; Bcl-2; Bax

(收稿日期:2014－11－17

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.004

【文章編號】1002－7386(2015) 09－1297－04

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【中圖分類號】R 780.2