吳瑞鋒劉俊峰高楊李保慶王金棟劉新波

鈣離子拮抗劑維拉帕米對(duì)人食管下括約肌舒縮的調(diào)節(jié)機(jī)制

吳瑞鋒1劉俊峰2高楊3李保慶2王金棟4劉新波2

目的通過(guò)比較鈣離子拮抗劑維拉帕米對(duì)由乙酰膽堿誘導(dǎo)的人食管下括約?。↙ES）套索纖維和鉤狀纖維肌條收縮的拮抗程度，探討維拉帕米對(duì)LES肌條舒縮的影響。方法應(yīng)用中上段食管癌患者LES作為研究對(duì)象，同時(shí)取食管體部和胃底肌條作為對(duì)照。分離出食管體部、胃底、套索纖維（sling）和鉤狀纖維（clasp）肌束，應(yīng)用離體肌條張力測(cè)定技術(shù)分別測(cè)定維拉帕米（10－3mol／L）對(duì)由乙酰膽堿（Ach）（濃度分別為10－6、10－5、10－4、10－3、10－2、10－1mol／L）誘導(dǎo)的4種肌條收縮的拮抗程度。結(jié)果食管環(huán)行肌組、胃底環(huán)形肌組和clasp組加入維拉帕米前后未見(jiàn)肌條收縮水平有明顯改變（t＝0.896，P＝0.372；t＝0.331，P＝0.741；t＝0.324，P＝0.747；t＝2.294，P＝0.023）。sling組加入維拉帕米后，收縮能力下降，收縮水平由（17.0±5.2）g降至（14.7±6.6）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.294，P＝0.023）。結(jié)論維拉帕米部分阻滯了LES套索纖維的收縮，從而導(dǎo)致了LES的舒張。

鈣離子； 食管； 括約??； 維拉帕米

人食管下括約?。╰he lower esophageal sphincter，LES）［1］由套索纖維（sling fibers）和鉤狀纖維（clasp fibers）共同構(gòu)成。這兩束肌肉共同維持LES的關(guān)閉狀態(tài)，并形成了LES高壓帶（high－pressure zon，HPZ）（15～30mmHg）（1mmHg＝0.133kPa）［2－3］。LES有自發(fā)產(chǎn)生基礎(chǔ)張力的特性，由此張力阻止胃內(nèi)容物反流入食管內(nèi)。

有關(guān)LES的舒縮調(diào)節(jié)機(jī)制仍是食管生理研究的熱點(diǎn)。目前臨床上應(yīng)用鈣離子（Ca2＋）拮抗劑治療賁門失遲緩癥等食管運(yùn)動(dòng)功能障礙性疾病，雖有一定的效果但并不能根本緩解，即使采取手術(shù)治療，很多患者術(shù)后仍有殘余癥狀甚至復(fù)發(fā)［4］。本研究應(yīng)用離體肌條張力測(cè)定技術(shù)分別測(cè)定Ca2＋拮抗劑維拉帕米對(duì)由乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）誘導(dǎo)的4種肌條收縮的拮抗程度，探討Ca2＋拮抗劑對(duì)人LES舒縮過(guò)程的影響，進(jìn)一步探索LES舒縮的調(diào)節(jié)機(jī)制，為臨床治療食管運(yùn)動(dòng)功能障礙性疾病提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、標(biāo)本制備

選取我院2013年5月至2015年4月收治的食管中上段癌行食管大部切除術(shù)患者6例，其中男女各3例，平均年齡56歲。所有患者術(shù)前均無(wú)燒心、反酸癥狀，亦無(wú)賁門失弛緩癥、硬皮病等可能導(dǎo)致LES功能障礙的疾病史。由于腫瘤位于食管中段或上段未累及胃食管連接部，所取胃食管連接部的標(biāo)本可認(rèn)作近似正常。手術(shù)室采集新鮮手術(shù)標(biāo)本后，立即放入4℃Krebs液中，送入實(shí)驗(yàn)室。Krebs液含NaCl 118.1mmol／L、KCl 4.7mmol／L、CaCl22.5mmol／L、MgSO41.2mmol／L、KH2PO41.2 mmol／L、NaHCO324.9mmol／L、葡萄糖10.0 mmol／L，pH值7.4。于室溫下將標(biāo)本黏膜面向上固定于盛有Krebs液的蠟盤中，持續(xù)通以5%CO2和95%O2混合氣體。銳性剝?nèi)ノ纲S門部及食管下段的黏膜層及黏膜下層后，在胃的大彎側(cè)及小彎側(cè)可分辨出兩個(gè)增厚的半環(huán)形平滑肌帶，分別為clasp和sling。然后在解剖顯微鏡下小心游離這兩束纖維及食管體部環(huán)行肌和胃底環(huán)行肌，制備成（0.5～1.0）cm×（0.1～0.2）cm的肌條，并在顯微鏡下觀察為正常平滑肌組織才能使用。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲患者及家屬知情同意。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)分為鉤狀纖維組（clasp）、套索纖維組（sling）、食管環(huán)行肌組和胃底環(huán)行肌組，分別將獲得的4個(gè)部位的肌條兩端以0號(hào)手術(shù)絲線扎緊，懸掛于已去除CaCl2的Krebs液（10ml）的離體器官灌流槽（南京美易科技有限公司）中，37℃恒溫，持續(xù)通以5%CO2和95%O2混合氣體。肌條下端固定，上端連接于JZ101型肌肉張力換能器（河北省新航機(jī)電設(shè)備有限公司），將換能器固定桿固定于可精確調(diào)節(jié)的升降架上，由Medlab離體器官檢測(cè)儀（南京美易科技有限公司）測(cè)定肌條張力，張力信號(hào)放大后經(jīng)Medlab信號(hào)采集系統(tǒng)（南京美易科技有限公司）記錄。平滑肌條固定好后，先溫浴1h，每20min更換已去除CaCl2的Krebs液一次。然后緩慢牽拉肌條，以剛好將肌條拉緊后的長(zhǎng)度為初始長(zhǎng)度（L0），在這一長(zhǎng)度時(shí)松弛肌肉不會(huì)產(chǎn)生明顯的張力變化，而進(jìn)一步牽拉則會(huì)使張力明顯升高。然后，多次緩慢牽拉肌條，每次增加其初始長(zhǎng)度的25%～50%，待被動(dòng)張力穩(wěn)定10min后再次牽拉。如此反復(fù)，約每20min牽拉一次，直至達(dá)到初始長(zhǎng)度的200%為最適初長(zhǎng)度。隨后進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)均在此條件下進(jìn)行。

待最適初長(zhǎng)度穩(wěn)定40min后，以濃度累積方式依次向浴槽中加入Ach（10－6、10－5、10－4、10－3、10－2、10－1mol／L），每增加一個(gè)濃度，都要在前一濃度達(dá)到最大反應(yīng)時(shí)加入，記錄張力變化值。濃度累積方式給藥所作的濃度反應(yīng)曲線與單獨(dú)濃度給藥方式類似。徹底沖洗肌條，加入維拉帕米（取維拉帕米的最適有效濃度為10－3mol／L）1min后，再以上述方式加入Ach，分別記錄四組的肌條張力變化值。試驗(yàn)完畢，取出肌條用濾紙吸干外附水分，用精密分析天平稱重，將所得張力變化值結(jié)合標(biāo)本重量、初始長(zhǎng)度及標(biāo)準(zhǔn)密度，換算出單位橫截面積張力值（mN／mm2）。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的方差分析（析因分析）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

食管環(huán)行肌、胃底環(huán)行肌、clasp、sling四組在不同濃度Ach誘導(dǎo)下加入維拉帕米后肌條收縮情況如圖1～4所示。其中食管環(huán)行肌、胃底環(huán)行肌和clasp三組的肌條在加入維拉帕米后收縮幅度與未加入前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（（t＝0.896，P＝0.372；t＝0.331，P＝0.741；t＝0.324，P＝0.747；t＝2.294，P＝0.023）；但sling組的肌條收縮在加入維拉帕米后受到抑制，肌束張力由（17.0±5.2）g降至（14.7±6.6）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.294，P＝0.023）（表1）。

圖2 胃底環(huán)行肌組加入維拉帕米前后肌條的收縮情況

圖3 clasp組加入維拉帕米前后肌條的收縮情況（n＝6）

圖4 sling組加入維拉帕米前后肌條的收縮情況（n＝6）

表1 加入維拉帕米前后4種肌條的收縮情況比較（n＝6，±s，g）

表1 加入維拉帕米前后4種肌條的收縮情況比較（n＝6，±s，g）

組別加阻滯劑前加阻滯劑后t值P值食管環(huán)行肌組14.6±4.2 14.0±3.2 0.896 0.372胃底環(huán)行肌組16.0±7.8 15.6±7.8 0.331 0.741 Clasp組15.6±6.0 15.3±6.0 0.324 0.747 Sling組17.0±5.2 14.7±6.6 2.294 0.023

討 論

Ca2＋拮抗劑在臨床上應(yīng)用廣泛，主要應(yīng)用于心腦血管疾病，在消化系統(tǒng)疾病中主要用于治療賁門失弛緩癥。常用藥物為硝苯地平［5］和維拉帕米，作用機(jī)制是阻滯外源性Ca2＋經(jīng)L－型鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，降低胞內(nèi)的Ca2＋濃度，而Ca2＋是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，高濃度的Ca2＋可引起平滑肌收縮，低濃度Ca2＋可引起平滑肌舒張［6］。

人LES由sling和clasp共同構(gòu)成。LES的壓力是不對(duì)稱的，高壓區(qū)偏向左側(cè)sling方向［7］。應(yīng)用毒蕈堿受體拮抗劑阿托品可明顯降低LES左側(cè)的壓力［1，8］，且體外實(shí)驗(yàn)也證明sling對(duì)Ach的敏感度更高，但鉤狀纖維卻有更大的自發(fā)張力［9－10］，表明clasp和sling在LES中存在不同的舒縮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。高立平、溫士旺等［11－13］在對(duì)人LES的一系列研究中已經(jīng)證明sling起到了主要作用。細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度的變化是導(dǎo)致兩種肌條對(duì)Ach反應(yīng)不同的原因，而這種不同與毒菌堿受體的亞型無(wú)關(guān)［1，7］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明Ca2＋拮抗劑維拉帕米主要作用于sling，即維拉帕米不能完全阻滯clasp和sling由Ach誘導(dǎo)的收縮，但維拉帕米可明顯降低sling收縮的程度，也就是部分地阻滯了sling的收縮，從而導(dǎo)致LES的舒張。

本研究結(jié)果與以往的相關(guān)研究不同，甚至相反。如在Ach對(duì)人LES肌細(xì)胞收縮作用和細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度的影響研究中發(fā)現(xiàn)，Ca2＋拮抗劑硝苯地平明顯降低了clasp平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度的升高幅度，而sling組則基本不受硝苯地平的影響，即硝苯地平阻滯了clasp卻不能阻滯sling的收縮反應(yīng)［5，14］。Muinuddin等［15］在對(duì)貓LES的環(huán)形肌和sling Ca2＋源的多樣性的研究中發(fā)現(xiàn)環(huán)行肌收縮被阻滯的程度遠(yuǎn)大于sling；應(yīng)用L型鈣離子通道阻滯劑時(shí)，環(huán)行肌被阻滯而sling的收縮卻不受影響。

綜合以上各因素分析導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)結(jié)果變化的原因如下：①LES在由Ach誘導(dǎo)的收縮過(guò)程中其不同肌組織利用鈣源的程度不同，sling主要依靠了外鈣內(nèi)流，且流經(jīng)L型鈣離子通道，而clasp則主要依靠細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)的Ca2＋的釋放；②Ca2＋不止是通過(guò)L－型鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，也可能經(jīng)T型鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)［16］；③LES的舒縮調(diào)節(jié)除受Ca2＋影響外，還受神經(jīng)、體液、內(nèi)分泌等多種因素不同調(diào)節(jié)機(jī)制的影響。結(jié)合臨床實(shí)踐，這也驗(yàn)證了Ca2＋拮抗劑并不能根治賁門失弛緩癥，而只是部分緩解癥狀的原因。因此，更深入地了解Ca2＋在LES舒縮過(guò)程中所起的作用、方式及研發(fā)出針對(duì)不同鈣源的阻滯劑，會(huì)為食管良性疾病的內(nèi)科保守治療帶來(lái)堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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Regulation mechanism of contraction and relaxation of human lower esophageal sphincter by calcium antagonist verapamil

Wu Ruifeng1，Liu Junfeng2，Gao Yang3，Li Baoqing2，Wang Jindong4，Liu Xinbo2.
1Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery，the First Central Hospital of Baoding，Baoding 071000，China；2the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；3School of Postgraduate，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；4Department of Cardiothoracic Surgery，the First People’s Hospital of Xuzhou，Xuzhou 221002，China

Liu Junfeng，Email：liujf＠heinfo.net

ObjectiveTo investigate the effects of calcium antagonist verapamil on the contraction and relaxation of human lower esophageal sphincter（LES）clasp and sling fibers induced by acetylcholine（Ach）.MethodsLES was obtained from patients with superior and middle esophageal carcinoma，and muscles of esophageal body and gastric bottom were served as controls.After isolation of muscle bundles of esophageal body，gastric bottom，sling fibers and clasp fibers，in vitro muscle stripe intensity measurement technique was employed to determine the effects of verapamil（10－3mol／L）on the contraction and relaxation of these four muscle stripes induced by Ach（10－6，10－5，10－4，10－3，10－2and 10－1mol／L）.ResultsThe contraction of circular muscles of esophageal body and gastric bottom and clasp fibers was not significantly changed after verapamil intervention（t＝0.896，P＝0.372；t＝0.331，P＝0.741；t＝0.324，P＝0.747）.However，the contraction of sling fibers was significantly decreased from（17.0±5.2）g to（14.7±6.6）g after verapamil intervention（t＝2.294，P＝0.023）.ConclusionsVerapamil partly blocks the contraction of LES，and results in the relaxation of LES.

Calcium iron； Esophagus； Sphincter； Verapamil

2015－04－29）

（本文編輯：周珠鳳）

10.3877／cma.j.issn.2095－8773.2015.03.004

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（C2010000622）

071000 保定市第一中心醫(yī)院心胸血管外科1；050011 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科2；050011石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院3；221002 徐州市第一人民醫(yī)院胸心外科4

劉俊峰，Email：liujf＠heinfo.net

吳瑞鋒，劉俊峰，高楊，等.鈣離子拮抗劑維拉帕米對(duì)人食管下括約肌舒縮的調(diào)節(jié)機(jī)制［J／CD］.中華胸部外科電子雜志，2015，2（3）：157－160.