張海英，閆玲玲，楊愛東，吳中華，符勝光，龐慧芳

(上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

加味小青龍湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB、鋅指蛋白A20表達(dá)的影響*

張海英，閆玲玲，楊愛東△，吳中華，符勝光，龐慧芳

(上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

目的:觀察加味小青龍湯對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB 65(NF-κB65)、鋅指蛋白A20蛋白及其基因表達(dá)的影響。方法:Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、地塞米松和加味小青龍湯組。采用脂多糖氣管滴注聯(lián)合煙熏方法建立COPD大鼠模型，檢測支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量，檢測肺組織NF-κB65、A20蛋白及其基因表達(dá)，觀察加味小青龍湯對上述指標(biāo)及肺組織病理形態(tài)學(xué)變化的影響。結(jié)果:與正常組比較，模型組TNF-α、IL-1β、NF-κB和A20蛋白及其基因表達(dá)均明顯上調(diào);與模型組比較，加味小青龍湯組TNF-α、白介素-1β、NF-κB蛋白表達(dá)明顯降低，加味小青龍湯組A20基因表達(dá)顯著上調(diào)。病理觀察結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組肺組織炎癥細(xì)胞浸潤，管腔中有大量中性粒細(xì)胞及黏液聚集，管壁明顯增厚，膠原染色顯示肺間質(zhì)纖維組織大量增生;加味小青龍湯組肺組織病理改變明顯輕于模型組，加味小青龍湯組肺組織少數(shù)呈輕度間質(zhì)性肺炎，僅見少量的纖維組織增生。結(jié)論:加味小青龍湯能夠減輕COPD模型大鼠肺組織損傷，對COPD模型肺組織有保護(hù)作用，其機(jī)理可能與其降低TNF-α和白介素-1β含量、下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)、上調(diào)A20基因表達(dá)有關(guān)。

加味小青龍湯;慢性阻塞性肺疾病;核轉(zhuǎn)錄因子-κB;鋅指蛋白A20

研究表明，在肺泡巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞中，炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)與核轉(zhuǎn)錄因子-(nuclear factor-κB，NF-κB)的激活相關(guān);而NF-κB在呼吸道炎癥的調(diào)節(jié)方面起關(guān)鍵作用，能促進(jìn)TNF-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β、IL-8的表達(dá)，加重慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的氣道炎癥［1］。鋅指蛋白 A20是NF-κB信號傳導(dǎo)的一種內(nèi)源性負(fù)調(diào)節(jié)子［2］。我們既往研究表明，加味小青龍湯對內(nèi)毒素致大鼠肺損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制與該方能降低急性肺損傷肺組織TLR4mRNA表達(dá)有關(guān)［3］。本研究觀察了加味小青龍湯對COPD大鼠肺組織NF-κB65、A20蛋白及其基因表達(dá)的影響，并探討加味小青龍湯的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

清潔級Wistar雄性大鼠32只，體質(zhì)量(220± 20)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供(動物合格證號SCXK(滬)2010-005)，專用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、水喂養(yǎng)。

1.2 藥物

加味小青龍湯由炙麻黃、桂枝、干姜、細(xì)辛、甘草、半夏、五味子、白芍、石膏、魚腥草、開金鎖11味中藥按一定比例組成。濃縮成2 g原藥材/mL的水煎液，高溫高壓滅菌，4℃冷藏備用。中藥飲片均購自上海曙光醫(yī)院東院，地塞米松購自上海信誼藥廠有限公司(批號01120302)。

1.3 儀器

低溫冷凍離心機(jī)3K15，Sigma(美國);生物安全柜TYPE B2，Sigma(美國);BH2顯微鏡OLYMPUS (日本);Real-time檢測儀(7300Sequence Detection System)、ABI-7300 ABI(美國)。

1.4 試劑

LPS凍干粉劑(O111:B4)購自美國Sigma公司(批號L1430);引物和探針序列。NF-kBp65:上游: 5'-GCGTTTCCGTTACAAGTGCG-3'，下游:5'-GTGCGTCTTAGTGGTATCTGTGC-3';A20:上游: 5'-AACTGGTGTCGTGAAGTCAGGA-3'，下游:5'-TCCTGAACACCCCACATGTACT-3';ACTIN:上游引物:5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'，下游引物: 5'-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3'，5'端FAM修飾，3'端Tamra修飾。Trizol總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增所需的酶及其他試劑均購自美國Invitrogen公司。白沙煙香煙(白盒，軟包)，湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，煙氣煙堿量1.0 mg，焦油12 mg，一氧化碳14 mg。自制煙熏箱:30 cm×40 cm×60 cm有機(jī)透明儲物箱。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、地塞米松組和加味小青龍湯組各8只。參照文獻(xiàn)［4］方法并加以改良建立COPD大鼠模型。分別于實驗開始的第1、14天給予氣管內(nèi)滴注脂多糖，劑量為2 mg/kg。分別于第2天至第13天及第15天至第28天，每日同一時間將大鼠置于72 L(寬30 cm，高40 cm，長60 cm)自制有機(jī)透明儲物箱內(nèi)，進(jìn)行香煙煙霧暴露1次，每次10支，每次0.5 h。暴露方法為:將點燃的白沙牌香煙通過懸掛方法，將煙霧注入自制箱內(nèi)。正常組用生理鹽水氣管滴注，在自制箱內(nèi)吸入正?？諝?。加味小青龍湯組在第2～13天、第15～28天給予大鼠灌服加味小青龍湯溶液(7.56 ml/kg)，地塞米松組灌胃劑量為0.2 mg/kg，正常組、模型組在相應(yīng)時點灌服等體積蒸餾水。各組動物用藥量按人與動物的體表面積換算［5］。

2.2 標(biāo)本采集

所有動物于造模后第29天用20%烏拉坦5.0 ml/kg腹腔麻醉。支氣管肺泡灌洗液收集:動物麻醉，大鼠頸部氣管縱行切口，用剝離針逐層分離組織，最終暴露氣管。于氣管下方置一零號手術(shù)線，用眼科剪橫剪一小口，用灌洗針(16號針頭改良而成)從剪開的小口處插入氣管，用手術(shù)線扎牢，再將針往氣管內(nèi)推入少許，用橡皮泥固定。用止血鉗夾住右側(cè)三葉的肺根部右支氣管，以免灌洗時被損傷。2次抽取3 ml生理鹽水灌洗支氣管，每次反復(fù)回抽3次，回收灌洗液于一離心管中，用于TNF-α、IL-1β測定。肺臟樣本:剖去肺部周圍組織，取右肺上葉，生理鹽水沖洗后放入10%甲醛溶液中保存，用于肺病理檢測及肺組織NF-kBp65、A20免疫組化檢測;取右肺下葉置于液氮罐中做肺組織 NF-kBp65、A20mRNA表達(dá)檢測。

2.3 肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β含量測定

取支氣管肺泡灌洗液，在離心機(jī)中3000 r/10 min后取上清液，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定灌洗液中的TNF-α、IL-1β含量。

2.4 肺組織NF-kBp65和A20蛋白表達(dá)測定

采用IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)軟件，對免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行圖像采集和定量分析。每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選擇不相重疊的3個視野，細(xì)胞核為藍(lán)色，NF-kBp65和A20陽性細(xì)胞為棕黃色。計算出每例樣本的蛋白染色陽性細(xì)胞面積率(蛋白染色陽性細(xì)胞面積率=陽性細(xì)胞面積/總面積)作為比較參數(shù)。

2.5 肺組織 NF-kBp65和 A20 mRNA表達(dá)測定

按美國Invitrogen公司Trizol試劑提取總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。12 μL反應(yīng)體系中，10 mmol/L dNTP1 μL，隨機(jī)引物1 μL，標(biāo)本RNA 2 μg，混勻后于65℃ 5 min快速插入冰水中離心，冰上加入:5×buffer 4 μL，DTT(100 mmol·L－1)2 μL，RNAsin(40 U/μL)1 μL，M-MLVRT反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)1 μL，37℃50 min，70℃ 15 min，－20℃保存。PCR擴(kuò)增:Sybr green 10 μL，上游引物:(5 μmmol· L－1)2 μL，下游引物:(5 μmmol·L－1)2 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL。擴(kuò)增條件:①95℃ 10 s;②95℃ 5 s，60℃ 20 s，40 Cycle。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software分析。NF-kBp65和 A20 mRNA表達(dá)水平以它們與ACTIN的相對表達(dá)量來計算。

2.6 病理觀察

取右上肺組織常規(guī)10%甲醛固定，逐級脫水，取1 cm×1 cm×0.3 cm石蠟包埋，用切片機(jī)切取一片漂片，HE及膠原染色，光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組均數(shù)采用方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 加味小青龍湯對大鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量的影響

表1顯示，與正常組比較，模型組支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，加味小青龍湯組和地塞米松組支氣管肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-1β含量顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)

表1 各組大鼠支氣管灌洗液中TNF-α、IL-1β含量比較(±s)

表1 各組大鼠支氣管灌洗液中TNF-α、IL-1β含量比較(±s)

注:與正常組比較:△△P＜0.01;與模型組比較:▲▲P＜0.01，▲P＜0.05

組別 鼠數(shù) TNF-α(pg/ml) IL-1β(pg/ml)正 常 組 8 154.6±7.85 75.63±4.94模 型 組 8 172.1±5.68△△ 83.04±3.93△△地 塞 米 松 組 8 159.2±11.72▲▲ 76.02±3.63▲▲加味小青龍湯組 8 159.7±11.74▲ 76.99±6.94▲

4.2 加味小青龍湯對大鼠肺組織NF-κB65、A20蛋白表達(dá)的影響

表2顯示，與正常組比較，模型組肺組織NF-κB65、A20蛋白陽性面積率明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，地塞米松組肺組織NF-κB蛋白陽性面積率明顯降低(P＜0.05)，肺組織A20蛋白陽性面積率明顯升高(P＜0.05)，加味小青龍湯組NF-κB蛋白陽性面積表達(dá)率明顯降低(P＜0.01)。

4.3 加味小青龍湯對大鼠肺組織NF-κB65、A20基因表達(dá)的影響

表3顯示，與正常組比較，模型組肺組織中NF-κB65、A20基因表達(dá)明顯升高(P＜0.05，P＜0.01);與模型組比較，地塞米松組肺組織NF-κB65基因表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，肺組織A20基因表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，加味小青龍湯組肺組織A20基因表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。

表2 各組大鼠肺組織NF-κB65、A20蛋白陽性面積率的比較(±s)

表2 各組大鼠肺組織NF-κB65、A20蛋白陽性面積率的比較(±s)

注:與正常組比較:△△P＜0.01;與模型組比較:▲▲P＜0.01，▲P＜0.05

組別 鼠數(shù) NF-κB65(%) A20(%)正 常 組 6 6.26±2.32 4.44±1.45模 型 組 6 10.47±2.88△△ 7.23±1.52△地 塞 米 松 組 6 7.67±1.56▲ 10.56±3.43△△▲加味小青龍湯組 6 6.41±1.06▲▲ 8.75±0.99△△

表3 各組大鼠肺組織NF-κB65、A20基因表達(dá)的比較(±s)

表3 各組大鼠肺組織NF-κB65、A20基因表達(dá)的比較(±s)

注:與正常組比較:△△P＜0.01，△P＜0.05;與模型組比較:▲▲P＜0.01，▲P＜0.05

組別 鼠數(shù) NF-κB65mRNA (×10－2) A20mRNA (×10－2)正 常 組 8 0.59±0.14 0.64±0.26模 型 組 8 0.89±0.25△△ 0.93±0.26△地 塞 米 松 組 8 0.73±0.11▲ 1.23±0.29△△▲加味小青龍湯組 8 0.76±0.10△ 1.35±0.23△△▲▲

4.4 各組大鼠肺組織病理形態(tài)觀察

圖1顯示，光鏡觀察正常組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺間質(zhì)無炎細(xì)胞浸潤，膠原染色未見明顯纖維組織增生;模型組肺組織炎癥細(xì)胞浸潤，管腔中有大量中性粒細(xì)胞及黏液聚集，管壁明顯增厚，膠原染色示肺間質(zhì)纖維組織大量增生;地塞米松組肺間質(zhì)極少量炎癥細(xì)胞浸潤，膠原染色示肺間質(zhì)少量纖維組織增生;加味小青龍湯組肺間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤，膠原染色示肺間質(zhì)少量纖維組織增生。

5 討論

COPD屬于中醫(yī)學(xué)“咳嗽上氣”“肺脹”“痰飲”“喘證”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為COPD為本虛標(biāo)實之證，內(nèi)臟陽氣不足是本虛，而重在肺、脾、腎三臟陽氣虛衰，寒飲內(nèi)停是其標(biāo)實，外感風(fēng)寒為主要誘因。肺脾腎陽氣不足，痰飲內(nèi)停，加之風(fēng)寒襲肺，肺衛(wèi)失宣，未能及時表散，內(nèi)蘊不解，郁而化熱，導(dǎo)致肺氣上逆而出現(xiàn)咳、痰、喘等表現(xiàn)。根據(jù)COPD的臨床癥狀，結(jié)合以往的治療經(jīng)驗我們認(rèn)為，COPD的病機(jī)演變早期多見外寒內(nèi)飲、郁久化熱，治宜溫肺化飲兼解郁熱，方選加味小青龍湯。

典型的NF-κB是異源二聚體，在調(diào)節(jié)機(jī)體基因轉(zhuǎn)錄中有重要作用。NF-κB與 IκB(inhibitor κB，IκB)的解離是活化的關(guān)鍵，而IκB磷酸化是IκB與NF-κB解離的前提［6］。NF-κB必須首先從胞漿進(jìn)入胞核活化，才能發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。許多因素均可導(dǎo)致NF-κB的活化，脂多糖、TNF-α和IL-1是誘導(dǎo)NF-κB活化很強(qiáng)的誘發(fā)因子［7］。NF-κB可通過調(diào)控細(xì)胞IL-1β、TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，參與肺部炎癥和免疫調(diào)節(jié)［8］。研究表明，COPD患者病情惡化時痰巨噬細(xì)胞NF-κB65的陽性表達(dá)明顯增加。從吸煙者和COPD患者氣管黏膜活檢中發(fā)現(xiàn)，氣道上皮細(xì)胞中NF-κB65陽性表達(dá)明顯增加，且與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)［9］，可見NF-κB在氣道炎癥中起關(guān)鍵作用，與COPD的嚴(yán)重程度有關(guān)。

A20是一種泛素修飾酶，其表達(dá)在受刺激的淋巴細(xì)胞和肺支氣管上皮細(xì)胞內(nèi)［10］。A20蛋白是機(jī)體重要的炎癥反應(yīng)負(fù)性調(diào)節(jié)子，研究表明，A20在呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用，能夠減輕小鼠過敏性炎癥反應(yīng)的發(fā)生［11］。鋅指蛋白 A20與NF-κB的過度活化有著密切聯(lián)系，A20能夠去除因NF-κB活化而涉及多種蛋白的泛素化鏈，抑制其活化來減少炎癥的發(fā)生，NF-κB活化能使A20表達(dá)增高，從而起到炎癥負(fù)性調(diào)節(jié)的作用［12-13］。缺失A20基因，增加IκB激酶(inhibitor of NF-κB kinase，IKK)的活性，從而促使NF-κB的活化延長［14］。

本實驗研究結(jié)果表明，與正常組比較模型組肺組織炎癥細(xì)胞浸潤，管腔中有大量中性粒細(xì)胞及黏液聚集，管壁明顯增厚，膠原染色顯示肺間質(zhì)纖維組織大量增生，表明COPD模型復(fù)制成功，且模型組支氣管肺泡灌洗液中，TNF-α和IL-1β含量、肺組織NF-κB和A20蛋白及基因表達(dá)升高，表明COPD發(fā)病機(jī)制與TNF-α和IL-1β含量、NF-κB和A20蛋白及其基因表達(dá)升高有關(guān)。與模型組比較，加味小青龍湯組肺組織病理改變減輕，且加味小青龍湯組支氣管肺泡灌洗液中，TNF-α和IL-1β含量、肺組織NF-κB蛋白表達(dá)明顯降低，肺組織A20基因表達(dá)明顯升高。表明加味小青龍湯能夠減輕COPD模型大鼠肺組織損傷，對COPD模型肺組織有保護(hù)作用，其機(jī)理可能與其能夠降低TNF-α和IL-1β含量、下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)、上調(diào)A20基因表達(dá)有關(guān)。

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Effects of modified Xiaoqinglong Decoction on the expression of nuclear transcription factor-κB and zinc protein A20 in lung tissue of rats with chronic obstructive pulmonary disease

ZHANG Hai-ying，YAN Ling-ling，YANG Ai-dong△，WU Zhong-hua，F(xiàn)U Sheng-guang，PANG Hui-fang
(Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，shanghai 201203，China)

Objective:To investigate Effects of Additional Xiao Qing Long Decoction(AXQLD)on Lung Expression of NF-kBp65 and A20 protein and its mRNA in rats with chronic obstructive pulmonary disease(COPD)．Methods:Wistar rats was randomly divided into normal control group，model control group．The COPD model of rats were bulit by the Lipopolysaccharide tracheal instillation and smudging．TNF-α and L-1β in the bronchoalevlar lavage fluid were measured，and the expression of NF-κB and A20 protein and its mRNA in lung tissue were measured．While the histopathology of the lung tissue was observed by light microscope．Results:Compared with the normal control group，TNF-α and IL-1β and the expression of NF-κB，A20 protein and its mRNA were obviously increased in model group．Compared with model group，TNF-α and IL-1β and the expression of NF-κB protein were obviously decreased in AXQLD group;The expression of A20mRNA was obviously increased in AXQLD group．Light microscope observation indicates that there were severe interstitial pneumonia，the destruction or disappearance of alveolar structure，the infiltration of the inflammatory cells，pulmonary interstitial fibrous tissue hyperplasia with great quantities in the model group．while the pathological manifestations were much more ameliorated than those of the model group，the mild interstitial pneumonia and only a small amount of fibrous tissue hyperplasia were showed in the AXQLD．Conclusion:AXQLD lessens the injury of lung tissue and has protective effects on COPD rats，the mechanism is possibly related to the inhibition of TNF-α，IL-1β，and down-regulatation the expression of NF-κB protein and up-regulatation the expression A20mRNA in COPD rats．

Additional Xiao Qing Long Decoction;Chronic obstructive pulmonary disease;NF-κB;A20

R258．5

B

1006-3250(2015)02-0149-04

2014-11-14

國家中醫(yī)藥管理局重點學(xué)科項目(中醫(yī)各家學(xué)說2009);上海市重點學(xué)科建設(shè)資助項目(S30301);上海市教委預(yù)算內(nèi)科研項目(2011JW89);上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床基礎(chǔ)學(xué)科建設(shè)、名師研究室及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院攀登計劃項目(12ZLJ08、Z1301011310、A1-N1401011326);上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新能力培養(yǎng)專項項目(P2910302)

張海英(1987-)，女，河南周口人，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)藥防治呼吸系統(tǒng)疾病的臨床與研究。

△通訊作者:楊愛東(1968-)，男，湖北宜昌人，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥防治呼吸系統(tǒng)疾病的臨床與研究，E-mail:aidongy@ 126．com。