任香怡，胡 勇，魏江平，馬云桐，徐世軍△

(1．四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點實驗室培育基地，成都 611137; 2．成都中醫(yī)藥大學，成都 611137)

通絡醒腦泡騰片對VD模型大鼠海馬細胞色素C氧化酶表達的影響*

任香怡1，2，胡 勇1，2，魏江平1，2，馬云桐1，2，徐世軍1，2△

(1．四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點實驗室培育基地，成都 611137; 2．成都中醫(yī)藥大學，成都 611137)

目的:考察通絡醒腦泡騰片對VD模型大鼠海馬細胞色素C氧化酶表達的影響。方法:2-VO永久性結扎法制作VD大鼠模型，采用Morris水迷宮檢測大鼠的學習記憶能力，采用免疫組織化學和圖像分析技術測定海馬細胞色素C氧化酶的表達。結果:通絡醒腦泡騰片能顯著縮短模型大鼠的逃避潛伏期，增加第一象限進入次數(shù)百分比，減少第三象限進入次數(shù)百分比，縮短總游泳路程，增強海馬細胞色素C氧化酶陽性表達，顯著增高其平均光密度值，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。結論:通絡醒腦泡騰片改善VD模型大鼠學習記憶能力與促進海馬細胞色素C氧化酶的表達有關。

通絡醒腦泡騰片;血管性癡呆;細胞色素C氧化酶

血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)是由腦血管疾病導致的記憶、認知功能障礙的臨床綜合征，其病理和臨床表現(xiàn)與阿爾茨海默病(AD)具有高度關聯(lián)性，近年來引起研究者的廣泛關注。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體產(chǎn)能障礙是VD慢性腦缺血后產(chǎn)生的早期損傷級聯(lián)反應，可通過下調代謝相關酶活性［1］、刺激氧化應激損傷加速VD的病理進程［2］。細胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase，CCO)作為線粒體跨膜整合蛋白，其活性是線粒體能量代謝障礙的內源性指標，也是神經(jīng)元損傷程度的標志［3］。通絡醒腦泡騰片是以古方芎歸湯為基礎創(chuàng)制的專利方藥，由川芎、黃芩、當歸組成，具有活血通絡、醒腦通竅、解毒益智的作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該制劑能改善小鼠癡呆模型的膽堿能神經(jīng)功能［4］，抑制AD大鼠海馬Tau蛋白磷酸化關鍵調控蛋白CDK5和GSK-3表達［5］，促進突觸素重塑［6］和胰島素降解酶［7］表達，改善神經(jīng)病理損害和提高學習記憶能力。為進一步評價通絡醒腦泡騰片抗癡呆的作用機制，本文探討了其對2-VO雙側頸總動脈永久結扎癡呆模型大鼠海馬CCO表達的影響。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑

通絡醒腦泡騰片(4.5 g原生藥/片)由本課題組自制(批號20100304)，甲磺酸雙氫麥角堿片(喜得鎮(zhèn))由天津華津制藥有限公司生產(chǎn)(批號2C834T);CCO酶一抗:兔抗大鼠IgG，美國Santa cruz公司產(chǎn)品(批號SC-23984)，二抗、三抗和顯色劑均由北京中衫金橋生物有限公司提供。

1.2 實驗動物

SD大鼠SPF級雌雄各半，體質量220～260 g，由成都達碩實驗動物有限公司所提供(生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2013-24);實驗場地為國家中醫(yī)藥管理局成都中醫(yī)藥大學中藥藥理三級實驗室(TCM2032043)，大鼠均在室溫22～24℃、明暗周期12 h/12 h條件下，自由飲水攝食。

1.3 實驗儀器

Morris水迷宮(WMT-100)，成都泰盟科技有限公司;Image-Pro6.0圖像分析系統(tǒng)，美國 Media Cybernetics，Inc。

2 方法與結果

取健康SPF級SD大鼠，雌雄各半，適應性喂養(yǎng)3 d后，Morris水迷宮實驗篩選學習記憶良好者用于造模。采用永久性結扎雙側頸總動脈法［8～9］制備VD模型，假手術組除不結扎外，其余造模步驟與模型組相同。手術后動物連續(xù)3 d肌肉注射硫酸慶大霉素注射液，每只0.3 ml。取術后1個月存活模型大鼠50只，按隨機數(shù)字表法分為5組，即模型對照組、喜得鎮(zhèn)組、通絡醒腦泡騰片高、中、低劑量組，每組10只，另取10只假手術組大鼠為平行對照。表1顯示，假手術組和模型對照組10 ml·kg－1生理鹽水，其余各組灌胃10 ml·kg－1相應藥物，每日1次，連續(xù)90 d。給藥第86天開始水迷宮訓練，每日1次，第90天進行定向航行和空間探索測定。行為學測定完成后處死大鼠，無菌條件下取腦組織，常規(guī)固定制片、切片，采用SP法進行免疫組織化學反應，具體方法參照說明書進行。采用 Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進行分析，并測定平均光密度(IA)(結果見圖1)。

表1 通絡醒腦泡騰片對VD模型大鼠行為學的影響(±s)

表1 通絡醒腦泡騰片對VD模型大鼠行為學的影響(±s)

注:與模型對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 鼠數(shù) 劑量(g/kg) 逃避潛伏期(s)第一象限進入次數(shù)百分比(%)第三象限進入次數(shù)百分比(%)總路程(cm)假 手 術 對 照 組 10 — 37.19±40.21＊＊ 24.80± 5.33* 23.70±4.55＊＊ 2687.38±389.36＊＊模 型 對 照 組 10 — 86.24±33.82 18.00±10.94 31.50±5.72 3308.75±694.07喜 得 鎮(zhèn) 組 10 0.70mg 50.89±42.92* 25.30± 7.36* 26.60±4.01* 2426.20±514.68＊＊通絡醒腦高劑量組 9 7.56 41.21±41.47* 25.78± 4.71* 23.22±4.47＊＊ 2719.80±427.96*通絡醒腦中劑量組 8 3.78 49.19±38.63* 30.38± 4.72＊＊ 21.00±5.37＊＊ 2712.87±503.65*通絡醒腦低劑量組 8 1.89 26.12±34.35＊＊ 25.25± 3.37* 23.13±3.04＊＊ 2694.30±349.98*

圖1 各組大鼠海馬CCO酶的表達(10×10)

表1顯示，與假手術組比較，模型對照組的逃避潛伏期顯著延長，第一象限進入次數(shù)百分比顯著降低，第三象限進入次數(shù)百分比顯著增高，游泳總路程顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型對照組比較，通絡醒腦泡騰片高、中、低3個劑量組對上述指標均有顯著回調作用(P＜0.05)。

圖1顯示，CCO主要分布于海馬、上顳葉，陽性呈棕黃色或黃色顆粒，表達于細胞漿，陰性細胞核為藍色;模型組海馬CCO顯著低表達，平均光密度較假手術組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);通絡醒腦各劑量組CCO均較模型對照組棕染顆粒顯著增多，著色變深，平均光密度值顯著增高(P＜0.01)。

3 討論

線粒體產(chǎn)能障礙是腦缺血后產(chǎn)生的早期損傷級聯(lián)反應，與VD病理進程密切有關［10］。腦組織是機體內能量代謝最活躍的器官之一，但其儲存的能量有限，血流中斷后僅能持續(xù)數(shù)分鐘的能量供應［11］。線粒體是物質氧化釋放ATP的最終場所［12］，也是氧自由基產(chǎn)生的主要部位［13］。缺血后大量氧自由基的聚集造成線粒體結構和功能受損，繼發(fā)腫脹、炎癥、抑制三羧酸循環(huán)中能量關鍵酶丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酮脫氫酶活性以及CCO mRNA的轉錄，破壞電子傳遞使葡萄糖氧化磷酸化受阻，ATP產(chǎn)生減少，進而引起腦神經(jīng)細胞損傷［14］。CCO作為呼吸鏈集合體中電子傳遞系的關鍵酶，主導線粒體內90%的分子氧消耗，其活性的強弱決定了線粒體能量代謝的高低。正常情況下，CCO保證氧能量代謝與神經(jīng)元活性之間的相互耦合［15］，其活性與神經(jīng)元活性呈正相關［16］。腦缺血時，海馬區(qū)神經(jīng)元需要更多的ATP修復胞內環(huán)境和失活的蛋白和脂質，ATP供應不足則干擾CCO的合成，導致氧自由基增加、線粒體內跨膜電位崩潰、鈣泵和線粒體攝取活性降低，引起胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)失調和水鈉貯留，并伴隨谷氨酸神經(jīng)毒性加重能量代謝障礙。另外CCO活性降低，也可反饋性激活Ras蛋白通路，抑制過氧化物酶活性，引起 H2O2大量蓄積中毒［17］，導致神經(jīng)細胞衰老，最終凋亡進而引起學習記憶功能的下降。

傳統(tǒng)醫(yī)學認為，缺血致腦損傷的主要病機是由氣滯、血瘀、痰阻久滯腦之脈絡，濁毒內生、敗壞腦髓所致。通絡醒腦泡騰片具有活血通絡、醒腦通竅、解毒益智的作用，理論上能夠改善缺血所造成的腦神經(jīng)細胞損傷。

本次實驗研究表明，通絡醒腦泡騰片能明顯縮短VD模型大鼠的逃避潛伏期，增加第一象限進入次數(shù)百分比，降低第三象限進入次數(shù)百分比，并能縮短游泳總路程，提示該制劑具有良好的改善VD模型學習記憶功能的作用;免疫組化檢測結果顯示，與假手術組比較，模型對照組海馬CCO陽性表達顆粒減少，平均光密度值顯著降低，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，同文獻報道一致［18］;通絡醒腦泡騰片能使模型大鼠海馬CCO陽性表達顆粒顯著增多，平均光密度值較模型對照組顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。以上結果與傳統(tǒng)醫(yī)學理論相符，同時提示通絡醒腦泡騰片改善VD模型大鼠學習記憶功能與促進海馬區(qū)CCO表達有關。

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Effects of Tongluo Xingnao effervescent tablets on expression of cytochrome C oxidase in cells in hippocampus of VD rat model

REN Xiang-yi1，2，HU Yong1，2，WEI Jiang-ping1，2，MA Yun-tong1，2，XU Shi-jun1，2△
(1．Sichuan Provincial Key Laboratory，Systematic Research and Development of Chinese Medicinal Resources，Province-Ministry Co-constructed State Key Lab Incubation Base，Chengdu 611137，China; 2．Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China)

Objective:To explore effects of Tongluoxingnao effervescent tablets on the expression of cytochrome c oxidase in hippocampus of vascular dementia(VD)model rats．Methods:Establishing VD model rats induced by permanent occlusion of bilateral common carotid arteries(2-VO)．Evaluating the learning and memory ability with the Morris water maze test，and measuring the expression of cytochrome c oxidase in hippocampus of rats with immunohistochemistry and imaging quantitative analysis．Results:On the one hand，as for the VD model rats，the tablets can notably decrease the escape latency and increase frequencies of percentage of entering into the first quadrant dwell，meanwhile it also can decrease the percentage of total numbers of the third quadrant dwell entries and shorten the total swim route．On the other hand，the tablets enhance the positive expression of cytochrome c oxidase in rats hippocampal，and significantly increase its average optical density value compared with the control group which reveals a statistical significance．Conclusion:The Tongluoxingnao effervescent tablets can improve the ability of learning and memory of VD model rats that is related with promoting the expression of cytochrome c oxidase in rats hippocampus．

Tongluoxingnao Effervescent Tablets;Vascular Dementia; Cytochrome C Oxidase．

R285.5

B

1006-3250(2015)02-0159-03

2014-08-05

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2013ZX09103002-008);中藥藥理四川省青年科技創(chuàng)新研究團隊(2014TD0007);四川省教育廳自然科學重點項目(12ZA041);成都市產(chǎn)業(yè)發(fā)展技術支撐計劃-高校院所應用基礎研究(12DXYB321JH-002)

任香怡(1989-)，女，四川廣安人，在讀碩士，從事中藥神經(jīng)與精神藥理學研究。

△通訊作者:徐世軍(1975-)，男，甘肅靜寧人，教授，從事中藥神經(jīng)與精神藥理學研究，Tel:028-61800231，E-mail:docxu @126．com。