陶仕英，牛建昭△，趙丕文，郝慶秀，楊美娟，孫艷玲，張麗娟

(1．北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，北京 100029;2．中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700)

β-谷甾醇對T47D細胞雌激素受體表達及其下游基因PS2的影響*

陶仕英1，牛建昭1△，趙丕文1，郝慶秀2，楊美娟1，孫艷玲1，張麗娟1

(1．北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，北京 100029;2．中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700)

目的:觀察β-谷甾醇對T47D細胞雌激素受體(estrogen receptor，ER)及下游基因PS2的影響，探討其植物雌激素樣作用機制。方法:以ER拮抗劑ICI182 780為工具藥，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測ERα、ERβ及PS2mRNA表達變化，western-blot技術(shù)檢測ERα、ERβ蛋白表達變化。結(jié)果:β-谷甾醇可誘導ERα、ERβ及PS2 mRNA表達，且上調(diào)ERβ更顯著，對PS2 mRNA的誘導作用可以被ICI182 780抑制，能夠上調(diào)ERα和ERβ蛋白表達，且可以被ICI182 780抑制。結(jié)論:β-谷甾醇可以通過ER途徑調(diào)節(jié)下游靶基因的表達而發(fā)揮植物雌激素樣作用。

β-谷甾醇;T47D;PS2;雌激素受體;植物雌激素

細胞雌激素受體(estrogen receptor，ER)是一類甾體激素核受體超家族成員，目前發(fā)現(xiàn)ER有兩種亞型，即ERα和ERβ。經(jīng)典的雌激素作用機制認為，ER上的配體結(jié)合區(qū)與配體雌激素結(jié)合，使ER發(fā)生二聚體化，進一步使ER上的DNA結(jié)合區(qū)與靶基因啟動子上的雌激素應(yīng)答元件相結(jié)合，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄［1］。β-谷甾醇(β-sitostero，BSS)是植物固醇的一種，廣泛存在于植物的種子和果實中。前期研究發(fā)現(xiàn)，10－7mol·L－1和10－8mol·L－1β-谷甾醇的促細胞增殖作用最強，且這種作用可以被雌激素受體完全拮抗劑ICI182 780抑制。對細胞周期的影響可以使S期細胞比例增加，細胞分裂增殖指數(shù)升高，說明β-谷甾醇在該濃度下具有植物雌激素樣作用，而從中草藥及天然植物中開發(fā)植物雌激素，防治與體內(nèi)激素水平相關(guān)腫瘤、心血管疾病及更年期綜合癥日益受到研究者的關(guān)注，因此對其作用機制的研究自然成為世界關(guān)注的熱點。本實驗將以ER陽性人乳腺癌細胞系T47D細胞為研究對象，通過觀察β-谷甾醇及在ICI182 780干預(yù)下，對ERα和ERβ的表達及下游基因PS2的影響，進一步探討β-谷甾醇發(fā)揮植物雌激素樣作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

β-谷甾醇購自中國藥品與生物制品檢定所，實驗時以無水乙醇溶解，終濃度為 10－7mol·L－1。DMEM(高糖)、無酚紅DMEM(高糖)、胎牛血清、活性炭-葡聚糖苷處理的胎牛血清(CDT-FBS)為Hyclone公司產(chǎn)品;雌二醇(E2)為Sigma公司產(chǎn)品; Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品;ICI182 780為Tocris公司產(chǎn)品;ERα:rabbit polyclonal antibody，ERβ:rabbit polyclonal antibody，Actin:rabbit polyclonal antibody和Peroxidase conjugated affinipure goat anti-ribbit IgG為Santa Cruz公司產(chǎn)品，One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.2 細胞株

人乳腺癌細胞株(T47D)購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心。

1.3 T47D細胞培養(yǎng)

雌激素敏感性人乳腺癌T47D細胞，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5%CO2，相對飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。實驗開始前4 d將細胞用PBS洗滌后，改用無酚紅DMEM(含5% CDT-FBS)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以增加細胞對雌激素樣物質(zhì)作用的敏感性。

1.4 Western blot檢測

將T47D細胞以5×105個/瓶的密度接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，24 h待細胞貼壁后加入受試物: 10－7mol·L－1β-谷甾醇，同時設(shè)置陽性對照組(10－8mol·L－1E2)和溶劑對照組(0.1%乙醇)。在β-谷甾醇和E2拮抗組中同時加入10－7mol·L－1ICI182 780。收集藥物處理48 h的待測細胞，預(yù)冷的PBS洗滌3遍后，加入RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，充分裂解后，低溫離心機12000 r·min－1離心15 min，Bradford法定量蛋白濃度，取20 μg蛋白加入上樣緩沖液，99℃變性5 min，10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，一抗4℃孵育過夜后加相應(yīng)二抗37℃孵育1 h，TBST緩沖液清洗3遍，每次15 min，將膜浸沒于配置好的ECL超敏感光混合液，暗室中經(jīng)顯影及定影獲得結(jié)果，并采用Bio-Rad公司的Quantity one軟件分析結(jié)果。

1.5 real-time PCR檢測

表1顯示，引物序列、片段長度和退火溫度。收集藥物處理48 h的待測細胞，加入1 ml Trizol分離提取總RNA，并進行RNA純度和濃度測定;利用One Step SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒進行實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)，按照試劑盒說明書進行;利用Roche Light Cycler2.0全自動熒光定量PCR儀軟件進行結(jié)果分析，mRNA的表達量用相對定量的方法來表示，采用2－△△Ct的方法［2］。

表1 ER及其下游基因引物序列及擴增產(chǎn)物片段長度

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有統(tǒng)計資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 β-谷甾醇及與ICI182 780作用下對T47D細胞ERα蛋白表達的影響

圖1表2顯示，與溶劑對照組比較，E2可誘導T47D細胞ERα蛋白表達水平顯著升高，相對表達量達2.81，且這種誘導作用可被雌激素受體完全拮抗劑ICI182 780抑制。10－7mol·L－1β-谷甾醇可誘導ERα蛋白表達，相對表達量達2.86，且同樣可以被ICI182 780抑制。

2．2 β-谷甾醇及與ICI182 780作用下對T47D細胞ERβ蛋白表達的影響

圖2表2顯示，T47D細胞ERβ蛋白低表達，溶劑對照組相對表達量僅有 0.21，E2可顯著誘導T47D細胞ERβ蛋白表達水平，相對表達量高于溶劑對照組達0.29，且可以被雌激素受體完全拮抗劑ICI182 780抑制。10－7mol·L－1β-谷甾醇可誘導ERβ蛋白表達，相對表達量達0.28，且同樣可以被ICI182 780抑制。

圖1 β-谷甾醇干預(yù)ERα蛋白的表達

圖2 β-谷甾醇干預(yù)ERβ蛋白表達

2.3 β-谷甾醇作用下對T47D細胞ERα和ERβmRNA表達的影響

表3顯示，相對表達量結(jié)果顯示:雌二醇可以誘導ERα和ERβmRNA表達，β-谷甾醇亦可上調(diào)ERα和ERβ，相對表達量明顯升高，且與雌二醇比較，上調(diào)ERβ表達更顯著，約為溶劑對照組的7倍左右。

表2 各組ERα和ERβ蛋白的相對表達量(±s)

表2 各組ERα和ERβ蛋白的相對表達量(±s)

注:與溶劑對照組比較:*P＜0.05;與雌二醇組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與β-谷甾醇組比較:☆P＜0.05，☆☆P＜0.01

組別 例數(shù) ERα ERβ溶 劑 對 照 3 2.19±0.05 0.21±0.04雌 二 醇 3 2.81±0.23* 0.29±0.01*β -谷 甾 醇 3 2.86±0.37* 0.28±0.03*雌 二 醇 + ICI 3 1.73±0.14△ 0.18±0.01△△β-谷甾醇 +ICI 3 1.61±0.23☆ 0.18±0.00☆☆

表3 β-谷甾醇對T47D細胞ERmRNA相對表達量的影響(±s)

表3 β-谷甾醇對T47D細胞ERmRNA相對表達量的影響(±s)

注:與溶劑對照組比較:＊＊P＜0.01

?

2.4 β-谷甾醇及與ICI182 780作用下對T47D細胞PS2表達的影響

表4顯示，雌二醇可誘導PS2 mRNA表達，誘導作用可以被雌激素受體完全拮抗劑ICI182 780拮抗，β-谷甾醇亦可誘導PS2 mRNA表達，相對表達量明顯增多，且ICI182 780能夠抑制其誘導作用。

表4 β-谷甾醇及ICI182 780對T47D細胞PS2 mRNA相對表達量的影響(±s)

表4 β-谷甾醇及ICI182 780對T47D細胞PS2 mRNA相對表達量的影響(±s)

注:與溶劑對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 例數(shù) PS2溶 劑 對 照 3 1雌 二 醇 3 10.73±0.65＊＊β - 谷 甾 醇 3 10.65±0.98*雌 二 醇 + ICI 3 2.79±0.73 β-谷 甾 醇+ ICI 3 0.72±0.11

3 討論

流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，許多與雌激素相關(guān)的疾病如骨質(zhì)疏松、心血管疾病、前列腺癌和子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤患病率與大豆的攝取呈負相關(guān)，尤其東亞國家因這些腫瘤導致的死亡率明顯低于歐美國家，這與以植物性食物為主的膳食習慣關(guān)系密切。大豆等植物性食物中富含大豆苷元、染料木黃酮、雞豆素A等植物雌激素成分，因此植物雌激素對這些疾病的保健和治療作用日益受到關(guān)注。β-谷甾醇存在于多種天然植物的堅果和種子中，也存在于多種藥用植物中，如白花蛇舌草、半夏、天南星、地黃、白芥子等，可以降低飲食中膽固醇的吸收，因此長期以來研究者主要研究其對心血管疾病的保護作用［3-4］。近年來，隨著研究的不斷深入，β-谷甾醇的抗腫瘤作用已成為研究熱點。應(yīng)用不同ER狀態(tài)的乳腺癌細胞株，研究者們［5-6］通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇能夠誘導ER(-)的乳腺癌細胞株MDA-MB-231凋亡、阻滯細胞周期進展等抑制其增殖;對于ER(+)乳腺癌細胞株MCF-7β-谷甾醇則有促進增殖作用。研究者認為，這種矛盾可能與β-谷甾醇具有植物雌激素樣作用有關(guān)。早在1993年，Malini T［7］等研究發(fā)現(xiàn)，單純或與E2合用β-谷甾醇可使去卵巢動物子宮質(zhì)量明顯增加。后來研究者們［8］發(fā)現(xiàn)，親代水貂喂養(yǎng)β-谷甾醇9個月，子代水貂通過妊娠和哺乳后相對子宮質(zhì)量低于正常對照組。這些實驗結(jié)果說明，β-谷甾醇具有植物雌激素作用，能引起動物生殖器官質(zhì)量的改變。隨后β-谷甾醇被作為植物雌激素進行了大量的體外實驗研究，研究發(fā)現(xiàn)［9］β-谷甾醇是弱的雌激素受體ERα和ERβ激動劑，尤其易于結(jié)合ERβ，但對于β-谷甾醇發(fā)揮植物雌激素作用的機制未見詳細報道。

本實驗應(yīng)用人乳腺癌T47D細胞作為研究對象，T47D細胞為ERα和ERβ雙陽性表達細胞，但以ERα表達占優(yōu)勢［10］。結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，ERβ蛋白在人乳腺癌T47D細胞的正常對照組中表達明顯低于ERα蛋白的表達。10－7mol·L－1β-谷甾醇可誘導T47D細胞ERα和ERβ蛋白表達，且這一作用可被雌激素受體完全拮抗劑ICI182 780所抑制。ICI182 780又名Fulvestrant，是一種甾體類雌激素受體完全拮抗劑，研究發(fā)現(xiàn)其可以通過多種途徑發(fā)揮生物學活性。Wakeling AE等［11］發(fā)現(xiàn)，ICI182 780可抑制雌二醇與ER的結(jié)合，其與ER結(jié)合親和力達雌二醇的89%。Fawell和Danvois等［12-13］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ulvestrant-ER結(jié)合破壞受體二聚體化及依賴能量的配體-受體復合物的核質(zhì)穿梭，從而影響受體的核定位。且這種受體-配體復合物不穩(wěn)定，增加ER受體蛋白的降解，細胞ER蛋白的下調(diào)并不伴隨ERmRNA的減少［14］。在基因水平上，本研究發(fā)現(xiàn) β-谷甾醇可誘導ERα和ERβ mRNA表達，且與E2比較對ERβ誘導作用更加顯著。大量體外實驗證實［15-16］，不同的植物雌激素對ERα和ERβ的親和力不完全相同，多數(shù)植物雌激素對ERβ的親和力高于ERα，如香豆雌酚對ERβ的親和力比ERα高7倍。本實驗結(jié)果也顯示，β-谷甾醇與E2比較，通過選擇性調(diào)節(jié)ER的活性而發(fā)揮作用。本實驗中T47D細胞ERα表達占優(yōu)勢，所以對其下游基因的誘導表達主要通過ERα介導，從而誘導PS2基因轉(zhuǎn)錄，相對表達量升高，并可以被ICI182 780拮抗。

以上結(jié)果說明，β-谷甾醇能夠通過ER誘導雌激素效應(yīng)基因的表達而發(fā)揮作用，同時也提示下一步實驗可進一步觀察β-谷甾醇通過ER募集的輔調(diào)節(jié)蛋白如何調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性，以期更全面、準確地分析不同雌激素類化合物的作用機制，為臨床用藥提供理論指導。

［1］McDonnell DP．The molecular determinants of estrogen receptor pharmacology［J］．Maturitas，2004，48(suppl 1):S7-S12．

［2］Livak KJ，Schmittgen TD．Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C (T))Method［J］．Methods，2001，25(4):402-408．

［3］Teupser D，Baber R，Ceglarek U，et al．Genetic regulation of serum phytosterol levels and risk of coronary artery disease［J］．Circ Cardiovasc Genet，2010 3(4):331-339．

［4］Sanclemente T，Marques-Lopes I，F(xiàn)ajó-Pascual M，et al．A moderate intake ofphytosterolsfrom habitualdietaffects cholesterol metabolism［J］．J Physiol Biochem，2009，65(4): 397-404．

［5］Park C，Moon DO，Ryu CH，et al．Beta-sitosterol sensitizes MDAMB-231 cells to TRAIL-induced apoptosis［J］．Acta Pharmacol Sin，2008，29(3):341-348．

［6］Ju YH，Clausen LM，Allred KF，et al．beta-Sitosterol，beta-Sitosterol glucoside，and a mixture of beta-Sitosterol and beta-Sitosterol glucoside modulate the growth of estrogen-responsive breast cancer cells in vitro and in ovariectomized athymic mice［J］．J Nutr，2004，134(5):1145-1151．

［7］Malini T，Vanithakumari G．Effect of beta-sitosterol on uterine biochemistry:a comparative study with estradiol and progesterone［J］．Biochem Mol Biol Int，1993，31(4):659-668．

［8］Rykkynen A，Nieminen P，Mustonen AM，et al．Phytoestrogens alter the reproductive organ development in the mink(Mustela vison)［J］．Toxicol Appl Pharmacol，2005，202(2):132-139．

［9］Gutendorf B，Westendorf J．Comparison of an array of in vitro assays for the assessment of the estrogenic potential of natural and synthetic estrogens，phytoestrogens and xenoestrogens［J］．Toxicology，2001，166(1-2):79-89．

［10］Strm A，Hartman J，F(xiàn)oster JS，et al．Estrogen receptor beta inhibits 17beta-estradiol-stimulated proliferation of the breast cancer cell line T47D［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101 (6):1566-1571．

［11］Wakeling AE，Bowler J．Steroidal pure antioestrogens［J］．J Endocrinol，1987，112(3):R7-R10．

［12］Fawell SE，White R，Hoare S，et al．Inhibition of estrogen receptor-DNA binding by the“pure”antiestrogen ICI 164，384 appears to be mediated by impaired receptor dimerization［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1990，87(17):6883-6887．

［13］Dauvois S，White R，Parker MG．The antiestrogen ICI182780 disrupts estrogen receptor nucleocytoplasmic shuttling［J］．J Cell Sci，1993，106(Part 4):1377-1388．

［14］Nicholson RI，Gee JM，Manning DL，et al．Responses to pure antiestrogens(ICI164 384，ICI182 780)in estrogen-sensitive and resistant experimental and clinical breast cancer［J］．Ann N Y Acad Sci．，1995，761:148-163．

［15］石書芳，俞超芹．植物雌激素及其作用靶點的研究進展［J］．中西醫(yī)結(jié)合學報，2005，3(5):408-410．

［16］Velders M，Solzbacher M，Schleipen B，et al．Estradiol and genistein antagonize the ovariectomy effects on skeletal muscle myosin heavy chain expression via ER-beta mediated pathways［J］．J Steroid Biochem Mol Biol，2010，120(1):53-59．

Effects of β-sitosterol on the expression of T47D cells estrogen receptors and its downstream gene PS2*

TAO Shi-ying1，NIU Jian-zhao1△，ZHAO Pi-wen1，HAO Qing-xiu2，YANG Mei-Juan1，SUN Yan-ling1，ZHANG Li-juan1
(1．School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China;2．Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medicinal Sciences，Beijing 100700，China)

Objective:To observe the effect of β-sitosterol on ER and downstream gene PS2 expression in breast cancer cell line T47D cells，and explore its phytoestrogenic mechanism．Methods:mRNA expressions of ERα，ERβ and its downstream gene PS2 in T47D were assessed by RT-PCR，protein expressions of ERα、ERβin T47D were assessed by western-blot．ICI182 780 was employed to observe the influence on the gene expressions of PS2 and protein expressions of ERα，ERβ．Results:β-sitosterol up-regulated ERα，ERβmRNA expression．PS2 gene are induced in response to β-sitosterol treatment．The effect on PS2 gene expression was inhibited by pure estrogen receptor antagonist ICI182780．β-sitosterol increased the level of T47D cells ERα，ERβ proteins expression，respectively．The effect was completely antagonized by ICI182 780．Conclusion:β-sitosterol up-regulated downstream gene PS2 expression through ER．And β-sitosterol possessed phytoestrogenic effect by activating ER．

β-sitosterol;T47D;PS2;Estrogen receptor; Phytoestrogen

R285．5

B

1006-3250(2015)02-0165-03

2014-11-14

國家自然科學基金資助項目(30772849，81273887);高等學校學科創(chuàng)新引智計劃資助項目(B07007);北京中醫(yī)藥大學自主選題項目(0100604006);教育部大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目(201310026056)

△通訊作者:牛建昭，E-mail:niujianzhao@126．com。