張莉恒, 丁 君, 韓昭衡, 常亞青, 宋 堅(jiān), 田 瑩, 白雪秋, 丁文君

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116023)

海參隸屬于棘皮動(dòng)物門(Echinodermate), 海參綱(Holothuroidea)。全世界海參約有 160個(gè)屬, 近1400種, 中國約有海參140種[1]。目前海參相關(guān)研究多為分子生物學(xué)[2-6]和遺傳育種[7]方面, 海參骨片形態(tài)學(xué)研究較少。海參體內(nèi)真皮層具骨片, 海參的骨片通常被認(rèn)為是胚胎期骨骼的存留, 其主要成分是碳酸鈣。不同種海參的骨片類型不同, 海參骨片是進(jìn)行海參分類的重要依據(jù)[8]。國內(nèi)外已有學(xué)者對海參骨片進(jìn)行了研究, 廖玉麟[9]對中國134種海參進(jìn)行了形態(tài)學(xué)分類; Massin等[10]對糙海參(Holothuria scabra)幼參的骨片發(fā)育進(jìn)行了研究; Richard Rasolofonirina和Michel Jangoux[11]對糙海參(H.scabra)幼蟲和稚參的骨片進(jìn)行了研究, 確定了糙海參(H.scabra)不同類型骨片出現(xiàn)的時(shí)期; 另外, 李赟等[12]比較了國內(nèi)外15種海參體壁的骨片類型; 文菁等[13]利用掃描電鏡對中國 6種熱帶海參體壁骨片的組成和類型進(jìn)行了研究, 豐富了海參骨片形態(tài)學(xué)的研究信息。

目前, 國內(nèi)外關(guān)于海參體壁骨片的研究有報(bào)道,但仿刺參各組織的骨片類型及骨片在不同組織中的分布, 各類型骨片的相對比例與仿刺參年齡相關(guān)關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。本研究以大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育的 1~3齡仿刺參(Apostichopus japonicus)為研究對象, 采用原位壓片法研究仿刺參各組織的骨片類型及應(yīng)用 SPSS軟件統(tǒng)計(jì)各類型骨片相對比例, 為仿刺參的基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供資料, 為其年齡鑒別提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用材料為大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育的1~3齡仿刺參, 1齡仿刺參平均體長為54.7 mm±1.5mm; 2齡仿刺參平均體長為81.7 mm±2.0mm; 3齡仿刺參平均體長為 102.3±1.8mm。按年齡將仿刺參分為3組, 每組取5頭, 分別取棘、縱肌、觸手、管足、呼吸樹、體壁和腸 7種組織進(jìn)行分析。其中每頭仿刺參取棘(6個(gè))、縱肌(5cm)、觸手(4~8根)、管足(4~8根)、呼吸樹(6 小枝)、體壁(背部, 1cm×1cm×1cm)、腸(上升腸、下降腸各4段, 每段1cm)7種組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用 NaClO法和原位壓片法兩種方法制備仿刺參各組織標(biāo)本, 比較樣本制備結(jié)果; 采用原位壓片法研究不同年齡仿刺參各組織骨片類型; 采用掃描電子顯微鏡法觀察仿刺參各組織骨片的顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.1 NaClO法

將仿刺參各組織用無菌海水沖洗干凈, 并用濾紙吸干水分, 將所取組織置于 1.5mL的離心管, 滴加0.5~1 mL30%次氯酸鈉溶液, 消化20~60 s, 可見離心管底部出現(xiàn)白色顆粒, 待白色顆粒完全沉淀后,用吸管吸取上層溶液, 蒸餾水重復(fù)漂洗3次。用吸管將骨片轉(zhuǎn)移到載玻片上, 置于自然條件下干燥, 將載玻片置于顯微鏡(Nikon ECLip5E 50i)下觀察, 并拍照。

1.2.2 原位壓片法

將所取仿刺參各組織用無菌海水沖洗干凈, 并用濾紙吸干水分, 將組織展開平鋪于玻片上, 并吸干組織周圍水分, 在組織樣上加蓋玻片, 輕輕敲擊蓋玻片, 使樣品充分分散(避免出現(xiàn)氣泡); 在顯微鏡(Nikon ECLip5E 50i)下觀察, 并拍照。

1.2.3 掃描電子顯微鏡法

將0.1mol/L PBS緩沖液滴入由NaClO法獲得的骨片樣品離心管, 靜止 5min左右, 待骨片沉淀后更換清洗液, 重復(fù)3次, 清洗NaClO等殘留物; 將含有骨片的溶液滴到載玻片上, 使用不同梯度叔丁醇(50%、70%、80%、90%、95%、100%)脫水, 每 3min更換一次梯度; 吸干叔丁醇, 并將骨片放到電鏡(JEOL JEM-1200EX)觀察臺(tái)上, 鍍膜并進(jìn)行觀察,拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel和SPSS16.0軟件對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢測, 顯著水平設(shè)置為P<0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 NaClO法和原位壓片法制備仿刺參各組織骨片標(biāo)本結(jié)果比較

采用NaClO法和原位壓片法均能獲得仿刺參各組織骨片標(biāo)本(圖1)。經(jīng)過NaClO法獲得的骨片已與組織分離, 由于不附帶其他組織, 標(biāo)本較干凈, 但骨片結(jié)構(gòu)已損壞, 且不能觀察到骨片在組織中的分布。原位壓片法制樣簡單, 骨片結(jié)構(gòu)較完整, 且能觀察到骨片在組織中的分布狀態(tài), 適于仿刺參各組織骨片的觀察統(tǒng)計(jì)。因此, 在以下研究不同年齡仿刺參各組織骨片類型分析采用原位壓片法, 而電鏡掃描法前期處理采用NaClO法。

圖1 仿刺參觸手骨片標(biāo)本Fig.1 The production of Apostichopus japonicus tentacle bone chips

2.2 仿刺參不同組織骨片類型分析

利用原位壓片法對不同年齡仿刺參各組織骨片類型及骨片在不同組織中的分布進(jìn)行分析, 仿刺參各組織中存在桌形體、扣形體、桿狀體、花紋狀體、復(fù)合盤狀骨片和長孔狀體 6種主要骨片類型。仿刺參各組織中的骨片類型存在差異(圖2)。仿刺參體壁中存在的骨片類型為扣形體、桌形體和桿狀體; 管足中存在的骨片類型為扣形體、桌形體和復(fù)合盤狀骨片, 其中復(fù)合盤狀骨片是管足特有的骨片類型; 棘中存在的骨片類型為扣形體、桌形體和桿狀體; 觸手中存在的骨片類型為扣形體、桌形體和桿狀體; 腸和呼吸樹中存在的骨片類型為花紋狀體; 縱肌中不存在任何類型骨片; 另外, 在3齡仿刺參的腸及呼吸樹中發(fā)現(xiàn)了C形體。

圖2 仿刺參不同組織骨片的顯微觀察圖Fig.2 Ossicles of different tissues of Apostichopus japonicus observed under microscope

利用Excel和SPSS16.0軟件對不同年齡仿刺參各組織中存在的不同類型骨片進(jìn)行記數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果見表1。

由表1可知, 仿刺參不同組織中桌形體骨片比例是不一致的, 在1齡仿刺參中, 體壁和觸手中桌形體相對比例較高, 分別達(dá)到 12.15%±2.99%和11.55%±2.69%; 2齡和3齡仿刺參中, 管足和棘中桌形體相對比例較高, 2齡仿刺參管足和棘中桌形體比例分別為21.83%±5.64%和24.16%±0.93%, 3齡仿刺參管足和棘中桌形體比例分別為 8.89%±4.84%和11.36%±3.22%。不同年齡仿刺參相同組織中桌形體骨片的相對比例也存在差異, 2齡仿刺參管足中桌形體骨片相對比例為 21.83%±5.64%, 顯著高于1齡仿刺參管足中桌形體相對比例(P<0.05); 2齡仿刺參棘和觸手中桌形體骨片相對比例分別為24.16%±0.93%和20.76%±2.34%, 顯著高于1齡和3齡仿刺參棘和觸手中桌形體相對比例(P<0.05)。

由表1可知, 仿刺參不同組織中扣形體骨片相對比例不一致, 1-3齡仿刺參棘和體壁中扣形體相對比例較高, 觸手中扣形體比例最低, 觸手中扣形體比例分別為 36.58%±6.13% 、49.61%±2.46%、7.68%±2.89%。不同年齡仿刺參相同組織中扣形體骨片相對比例具有顯著差異性, 2齡仿刺參棘中扣形體相對比例為65.45%±1.79%, 顯著低于1齡和3齡仿刺參棘中扣形體(P<0.05); 3齡仿刺參觸手中扣形體相對比例為7.68%±2.89%, 顯著低于1齡和2齡仿刺參觸手中扣形體(P<0.05)。

表1 不同年齡仿刺參不同組織各類型骨片分析Tab.1 The types of ossicles of different tissues in Apostichopus japonicus Selenka with different ages

2.3 仿刺參各組織骨片顯微結(jié)構(gòu)觀察

在掃描電子顯微鏡下觀察仿刺參骨片的顯微結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)不同組織中相同類型骨片的形態(tài)結(jié)構(gòu)一致,不存在組織間特異性。桌形體骨片(圖3A)由底盤和立柱組成, 底盤近似為圓形, 具有穿孔, 底盤邊緣具突起, 中央有1塔部, 由4個(gè)立柱和1個(gè)橫梁構(gòu)成?？坌误w(圖3B)近似于圓形或橢圓形, 具有大小不等的圓孔, 通常中央部位圓孔較大, 邊緣部位圓孔較小, 與桌形體的底盤類似, 本次研究在電鏡下還發(fā)現(xiàn)了部分扣形體一面具有 4個(gè)突起痕跡(箭頭所示),推測可能與桌形體的 4個(gè)立柱存在某種關(guān)系。桿狀體主要存在于體壁、棘和觸手等外部組織中, 桿狀體(圖3C)是最簡單的骨片, 不分枝, 表面具有瘤。長孔狀體(圖3D)為長橢圓形, 兩側(cè)分布大小不等、近似橢圓形的細(xì)孔?；y狀體(圖3E)為呼吸樹和腸中所特有的骨片, 呈“8”字型, 邊緣有不規(guī)則排列的卷曲狀分枝, 每個(gè)分枝孔并不光滑, 表面具有小突起。復(fù)合盤狀骨片是仿刺參管足所特有的骨片, 其形狀近似圓形, 為多層網(wǎng)狀, 由許多小骨片組成, 具有突起,附著扣形體和桌形體(圖3F)。

圖3 不同類型骨片的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscopy images of different types of ossicles

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)方法

國內(nèi)外學(xué)者對于海參骨片形態(tài)學(xué)研究通常采用NaClO法、NaOH法、蛋白酶法, 本研究采用NaClO法和原位壓片法。通過比較NaClO法和原位壓片法兩種實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn), 原位壓片法具有制樣簡單, 骨片不易碎, 結(jié)構(gòu)較完整, 以及能顯示出骨片在組織中的分布狀態(tài)等優(yōu)點(diǎn), 同時(shí)具有制作的骨片標(biāo)本觀察不夠清晰的缺點(diǎn), 原位壓片法是一種適于觀察骨片完整結(jié)構(gòu)的方法, 推薦使用原位壓片法觀察骨片。NaClO法能觀察到較干凈的骨片, 但骨片損壞、結(jié)構(gòu)不完整。所以本研究在對不同年齡仿刺參各組織骨片類型進(jìn)行分析時(shí)采取原位壓片法, 使能觀察到較完整的骨片, 而電鏡掃描法前期處理采用NaClO法。

3.2 仿刺參各組織中骨片類型分析

研究仿刺參不同組織的骨片類型發(fā)現(xiàn), 不同組織間骨片類型具有差異性, 例如, 管足中存在獨(dú)特的復(fù)合盤狀骨片; 腸和呼吸樹中存在花紋狀體; 縱肌中不含有任何類型骨片; 另外, 在3齡仿刺參腸和呼吸樹中發(fā)現(xiàn)了 C形體, 而通常認(rèn)為仿刺參中不存在 C形體骨片[9]。陳建偉等[14]同時(shí)比較了海參背脊部、腹部、觸手、口部和肛門部骨片的特征, 結(jié)果表明, 海參不同部位骨片類型存在明顯不同, 例如, 背部多為扣形體, 觸手多為桿狀體骨片, 與本研究結(jié)果有相同之處。進(jìn)一步比較不同組織中相同類型骨片發(fā)現(xiàn), 仿刺參不同組織中相同類型骨片的形態(tài)結(jié)構(gòu)一致, 無組織特異性, 如管足和體壁中的桌形體骨片形態(tài)結(jié)構(gòu)一致。Delboni[15]研究了Synaptula hydriformis海參的骨片生長, 并記錄了錨形體等骨片類型的生長變化過程。本研究發(fā)現(xiàn)扣形體一面存在4個(gè)突起痕跡, 推測為桌形體退化形成, 是否能作為仿刺參骨片間類型轉(zhuǎn)化依據(jù)還有待進(jìn)一步探索。本研究為仿刺參的基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供資料。

3.3 不同年齡仿刺參不同組織各骨片相對比例分析

國外學(xué)者 Rowe[16]認(rèn)為海參骨片類型的進(jìn)化過程是由簡單到復(fù)雜, 例如由桿狀體和花紋狀體進(jìn)化到桌形體和扣形體, Levin的結(jié)論與之相反, 認(rèn)為骨片進(jìn)化過程是由復(fù)雜到簡單。本研究發(fā)現(xiàn)隨著仿刺參年齡的增長發(fā)現(xiàn), 不同年齡仿刺參不同組織各類型骨片的比例是動(dòng)態(tài)變化的, 例如, 桌形體骨片的“桌腿”消失; 1齡仿刺參體壁、觸手中桌形體的含量高于管足和棘, 但到了2齡、3齡, 管足和棘中的桌形體的含量高于體壁和觸手。這種變化造成不同年齡仿刺參不同組織中各類型骨片的相對比例存在差異。對于桌形體骨片, 1齡、2齡、3齡仿刺參觸手間桌形體骨片相對比例存在顯著差異性(P<0.05)。對于扣形體骨片, 2齡仿刺參棘中扣形體骨片相對比例顯著低于 1齡和3齡仿刺參棘中扣形體相對比例(P<0.05)。通過仿刺參各組織不同類型骨片相對比例綜合分析, 可為仿刺參的年齡判斷提供參考。

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