田 野 , 邵艷卿, , 肖國強, , 滕爽爽, , 柴雪良 , , 張炯明, , 方 軍,

(1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 溫州 325005; 2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 浙江 溫州 325005; 3.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)和保護重點實驗室, 浙江 溫州 325005)

泥蚶(Tegillarca granosa)屬軟體動物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、蚶目(Arcoida)、蚶科(Arcidae)動物,廣泛分布于我國南北各沿海地區(qū)及韓國、越南、馬來西亞等, 為我國傳統(tǒng)四大養(yǎng)殖經(jīng)濟貝類之一。因其具有獨特的風(fēng)味及豐富的營養(yǎng)價值而深受人們喜愛。20世紀(jì)90年代初期, 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所等單位率先突破了泥蚶規(guī)?；a(chǎn)性人工育苗技術(shù), 自此以后, 泥蚶養(yǎng)殖獲得快速發(fā)展, 泥蚶養(yǎng)殖所用苗種也絕大部分由人工苗種所替代[1]。浙江樂清灣一帶也成為國內(nèi)最主要的泥蚶人工苗種產(chǎn)地。

但近年來研究發(fā)現(xiàn), 因長期以來生產(chǎn)性養(yǎng)殖的泥蚶, 主要通過人工育苗提供苗種, 苗種繁育所用親貝均為人工養(yǎng)成, 經(jīng)過多年自繁自養(yǎng)和親貝的隨意選留, 加劇了泥蚶的近交衰退, 已不同程度地出現(xiàn)了遺傳多樣性減低、雜合度下降、生長速度減緩、抗逆性差、性狀退化等問題[2]。微衛(wèi)星標(biāo)記(simple sequence repeat, SSR), 具有多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、重復(fù)性好、操作分析簡單等優(yōu)點, 已被廣泛用于群體遺傳多樣性評價、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域[3]。進行選育時, 因近交機率增加和有效親本數(shù)的減少, 可能導(dǎo)致選育群體的遺傳多樣性下降, 進而引起選育群體的性狀衰退[4], 雖然一些研究報道了貝類養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與野生群體相比未發(fā)生明顯變化[5-8], 但貝類的苗種培育和群體選育過程中, 常因親本數(shù)量過少、雌雄比例不當(dāng)、親本貢獻不均、配子質(zhì)量差異、配子競爭、人工選優(yōu)和選型交配等因素, 引起有效群體數(shù)量的減少,從而降低選育群體的遺傳多樣性[9-14]。

目前國內(nèi)對于貝類選育群體遺傳多樣性的分析已有不少報道: 王慶志等[15]對長牡蠣人工選育群體的微衛(wèi)星分析; 王學(xué)穎等[16]對馬氏珠母貝金黃殼色系和基礎(chǔ)群體遺傳結(jié)構(gòu)進行比較; 本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記對泥蚶連續(xù) 3代選育群體的遺傳多樣性進行分析, 與基礎(chǔ)群體進行比較, 考查隨著選育代數(shù)的進行群體各種遺傳指數(shù)的變化規(guī)律, 為進一步優(yōu)化育種方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

本研究采集的泥蚶樣品為經(jīng)浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所連續(xù)多年選育的F3代, F4代, F5代速生群體, 選育策略為群體內(nèi)個體選擇結(jié)合家系/亞群選擇,同時以最早保存的未經(jīng)選育的基礎(chǔ)群體作為對照組。F3, F4, F5代個體均從群體中隨機選取65個, 于–70℃冰箱中保存?zhèn)溆? 基礎(chǔ)群體35個于2007年保存在–70℃冰箱備用。

1.2 DNA提取

采用常規(guī)的蛋白酶 K 消化, 酚-氯仿-異戊醇抽提, 無水乙醇沉淀的方法提取基因組 DNA; 用瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 用紫外分光光度計檢測DNA純度與濃度, 選取電泳條帶較亮且濃度較高的DNA稀釋成統(tǒng)一濃度, 保存于4℃冰箱中用于后續(xù)實驗。

1.3 PCR擴增及產(chǎn)物檢測

從39對泥蚶微衛(wèi)星引物中[17]篩選出12對作為本研究使用的引物, 并對引物退火溫度進行優(yōu)化。引物由上海生工公司合成, 其編號及序列見表1。

表1 引物編號及序列Tab.1 Primer number and sequences

PCR反應(yīng)體系為15 μL, 包含100 ng模板DNA,1×PCR緩沖液, 0.4UTaKaRa Taq DNA聚合酶, 2.5 mmol/L MgCl2, 0.25 mmol/L dNTP混合液, 上下游引物各0.7 μmol/L。PCR擴增條件為: 94℃ 預(yù)變性5 min,然后30個循環(huán), 每個循環(huán)包括: 94℃ 30 S, 49~56℃退火30 S, 72℃延伸45 S。PCR產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳, 50 bp DNA ladder (Takara)作為Marker檢測產(chǎn)物位置, 硝酸銀法染色, 條帶結(jié)果由人工讀取、統(tǒng)計。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計每個位點的等位基因數(shù)量(Observed number of allele,No), 用 Popgene 32(1.32)分析數(shù)據(jù), 計算有效等位基因數(shù)(Effective number of allele,Ne),Shannon遺傳多樣性指數(shù)(Shannon genetic ranged index,Rs), 近交系數(shù)(Wright's fixation index,Fis), 觀測雜合度(Observed heterozygosity,Ho), 期望雜合度(Expected heterozygosity,He)以及哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)。PIC_Calc 0.6(http://www.bbioo.com/download/58-247-1.html)計算多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)。

2 結(jié)果

2.1 遺傳多樣性

泥蚶基礎(chǔ)群體和選育群體的遺傳參數(shù)結(jié)果如表2所示。12個位點均表現(xiàn)出多態(tài)性: 基礎(chǔ)群體各位點有效等位基因數(shù)1.69~6.30個, 平均3.16個; F3代為1.52~3.88個, 平均2.71個; F4代1.15~4.75個, 平均2.73個; F5代1.57~5.17個, 平均2.58個; 表明隨著群體選育的進行, 等位基因數(shù)總體呈現(xiàn)下降趨勢。所有群體12個位點觀測雜合度(Ho)均小于期望雜合度(He)。觀測雜合度平均范圍為 0.4195~0.4725, 期望雜合度平均范圍為 0.5700~0.6323, 表明各位點有一定程度的雜合子缺失。在 48個群體-位點組合中有32個群體-位點組合顯著偏離平衡(P<0.05), 約占總數(shù) 66.67%。Shannon遺傳多樣性指數(shù)平均值為1.06~1.22。各位點多態(tài)信息含量范圍0.1119~0.8209。

表2 泥蚶4個群體的遺傳多樣性分析Tab.2 Genetic variability analysis of 4 blood clam T.granosa populations

2.2 遺傳分化

4個群體間不同位點的遺傳分化系數(shù) Fst值從0.0347~0.4549, 平均值 0.1930, 相關(guān)文獻認(rèn)為遺傳分化程度比較大(處于 0.15~0.25之間); 基因流Nm值為 0.2996~6.9617, 平均值 2.3367; 群體近交系數(shù)Fis范圍0.0052~0.7135, 平均值0.2468, 表明群體的近交程度較高。

續(xù)表

表3 4個泥蚶群體的基因分化與基因流Tab.3 Gene differentiation and gene flow of 4 blood clam T.granosa populations

3 討論

遺傳育種、保護種質(zhì)資源等相關(guān)工作能順利開展的前提和基礎(chǔ)是維持群體的遺傳多樣性, 群體遺傳多樣性的高低與其適應(yīng)能力、生存能力和進化潛力密切相關(guān)。遺傳多樣性降低可導(dǎo)致其適應(yīng)能力降低、有害隱性基因表達增加及經(jīng)濟性狀衰退, 最終導(dǎo)致物種退化[18]。因此, 為了保證選育工作的順利進行并獲得高質(zhì)量的選育新品種, 保持群體的遺傳多樣性是非常重要的。

3.1 泥蚶群體的遺傳多樣性分析

多態(tài)信息含量、等位基因數(shù)、遺傳多樣性指數(shù)都是體現(xiàn)群體遺傳多樣性的量度參數(shù)。文獻中認(rèn)為PIC>0.5時為高度多態(tài)性位點, 0.25

Shannon遺傳多樣性指數(shù)(Rs)在3個選育群體中的變化不大, 而與基礎(chǔ)群體相比較略有下降, 在王慶志[15]對長牡蠣的報道中的數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)結(jié)果是相似的。說明隨著選育的進行, 遺傳多樣性指數(shù)趨于穩(wěn)定。3代連續(xù)選育的群體平均有效等位基因數(shù)與基礎(chǔ)群體相比有所下降, 但選育群體之間變化不大, 基本穩(wěn)定。12個位點PIC平均值: F3、F4、F5代分別為0.5406、0.5251、0.5170; 基礎(chǔ)群體PIC平均值為0.5808。以上結(jié)果表明與基礎(chǔ)群體相比較, 選育的遺傳多樣性雖有一定程度的下降, 但是隨著選育的進行, 群體多樣性各指標(biāo)趨于穩(wěn)定。

3.2 泥蚶群體遺傳分化分析

遺傳分化指數(shù)(Fst)反映群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)。從本研究的結(jié)果來看: 4個群體中12個位點的Fst值范圍0.0347~0.4549, 平均值為0.1930。表明有19.3%的變異是由群體分化導(dǎo)致的, 而80.7%的變異來源于群體內(nèi), 群體間的遺傳變異程度處于一般水平。Wright[21]認(rèn)為, 基因流Nm大于1時, 能夠發(fā)揮其均質(zhì)化作用, 從而抑制由遺傳漂變引起的群體間分化。而在本研究中, 12個位點中有8個位點的Nm值大于1, 說明群體間的交流程度比較高。馬春艷等[22]對凡納濱對蝦引進群體和 2個養(yǎng)殖群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析中得到的Fst值為0.0500~0.1657,王學(xué)穎等[16]對馬氏珠母貝金黃殼色系F3和基礎(chǔ)群體遺傳結(jié)構(gòu)比較研究中得到的Fst值范圍為 0.0031~0.1478, 李云霞等[23]對刺參群體遺傳結(jié)構(gòu)分析及與經(jīng)濟性狀的相關(guān)性研究中的Fst值為0.0130~0.1805,湯健等[24]對馬氏珠母貝家系遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星分析中的Fst值 0.0375~0.2733, 這些結(jié)果都比本研究的結(jié)果要低, 產(chǎn)生此差異的原因可能是由于引物設(shè)計的不同產(chǎn)生結(jié)果差異, 由于引物定位的位置不同,生物群體在該位置發(fā)生不同變異。

本研究結(jié)果表明, 在經(jīng)過連續(xù)的人工選育過程,對群體的遺傳多樣性與基礎(chǔ)群體相比有一定程度的降低, 但仍處于較高水平。這與我們育種選取的方式有關(guān): 因為采用群體選育方式確保了有效繁育群體數(shù)量所以遺傳多樣性下降較慢, 但針對某個性狀選育的進展較慢, 若采用家系選育方式, 雖然就某個性狀而言選育進展較快, 但遺傳多樣性也下降較快。因此, 我們采用群體選育結(jié)合家系選擇的方式, 雖然有一定程度的下降, 但下降程度不顯著。從研究的結(jié)果來看, 經(jīng)連續(xù)選育的泥蚶群體遺傳分化程度還比較低, 并且其遺傳多樣性和遺傳分化程度逐漸趨于穩(wěn)定。所以, 泥蚶育種仍有非常大的潛力進行優(yōu)良性狀的篩選。但今后應(yīng)避免近交繁殖對選育群體的優(yōu)良性狀產(chǎn)生的不良影響, 確保泥蚶育種工作的持續(xù)健康進行。

[1] 劉博, 滕爽爽, 柴雪良, 等.泥蚶遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[J].海洋與湖沼, 2012, 43(5): 983-991.

[2] 呂振明, 李太武, 蘇秀榕.泥蚶遺傳多樣性的研究[J].高技術(shù)通訊, 2005, 15(12): 104-110.

[3] Wright J M, Bentzen P.Microsatellites: genetic markers for future[J].Reviews in Fish Biology and Fisheries, 1994, 4(3): 384-388.

[4] Beaumont A, Boudry P, Hoare K.Biotechnology and genetics in fisheries and aquaculture[M].Singapore:Wiley-Blackwell, 2010.

[5] Durand P, Wada K T, Blanc F.Genetic variation in wild and hatchery stocks of the black pearl oyster,Pinctada margarififera, from Japan[J].Aquaculture,1993, 110(1) : 27-40.

[6] English L J, Maguire G B, Ward R D.Genetic variation of wild and hatchery populations of the Pacific oyster,Crassostrea gigas(Thunberg), in Australia[J].Aquaculture,2000, 187(3-4): 283-298.

[7] Li Q, Yu H, Yu R H.Genetic variability assessed by microsatellites in cultured populations of the Pacific oyster(Crassostrea gigas) in China[J].Aquaculture,2006, 259(1-4): 95-102.

[8] Zhao C, Li Q, Kong L F.Inheritance of AFLP markers and their use for genetic diversity analysis in wild and farmed scallop (Chlamys farreri)[J].Aquaculture, 2009,287(1-2): 67-74.

[9] Hedgecock D, Sly F.Genetic drift and effective population sizes of hatchery-propagated stocks of the Pacific oyster,Crassostrea gigas[J].Aquaculture, 1990, 88(1): 21-38.

[10] Boudry P, Collet B, Cornette F, et al.High variance in reproductive success of the Pacific oyster (Crassostrea gigas, Thunberg)revealed by microsatellite-based parentage analysis of multifactorial crosses[J].Aquaculture,2002, 204 (3-4): 283-296.

[11] Taris N, Ernande B, McCombie H, et al.Phenotypic and genetic consequences of size selection at the larval stage in the Pacific oyster(Crassostrea gigas)[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,2006, 333(1): 147-158.

[12] Appleyard S A, Ward R D.Genetic diversity and effective population size in mass selection lines of Pacific oyster(Crassostrea gigas)[J].Aquaculture, 2006,254(1-4): 148-159.

[13] Lind C E, Evans B S, Knauer J, et al.Decreased genetic diversity and a reduced effective population size in cultured silver-lipped pearl oysters(Pinctada maxima)[J].Aquaculture, 2009, 286(1-2): 12-19.

[14] Li R H, Li Q, Yu R H.Parentage determination and effective population size estimation in mass spawning Pacific oyster(Crassostrea gigas)based on microsatellite loci analysis[J].Journal of the World Aquaculture Society, 2009, 40(5): 667-677.

[15] 王慶志, 李琪, 孔令鋒.長牡蠣3代人工選育群體的微衛(wèi)星分析[J].水產(chǎn)學(xué)報, 2012, 36(10): 1529-1536.

[16] 王學(xué)穎, 高遠(yuǎn)鎮(zhèn), 杜曉東, 等.馬氏珠母貝金黃殼色系 F3和基礎(chǔ)群體遺傳結(jié)構(gòu)比較[J].海洋通報, 2012,31(3): 324-328.

[17] Liu B, Teng S S, Shao Y Q, et al.Isolation and characterization of 39 novel polymorphic EST-SSR loci for the blood clam,Tegillarca granosa[J].Conservation Genet Resour, 2012, 4: 375-378.

[18] Beaumont A, Boudry P, Hoare K.Biotechnology and genetics in fisheries and aquaculture[M].Singapore:Wiley-Blackwell, 2010.

[19] Botstein D, White R L, Skolnick M, et al.Construction of a genetic linkage map in mall using restriction fragment length polymorphisms[J].Am J Hum Genet,1980, 32: 314-331.

[20] 劉博, 邵艷卿, 王侃, 等.4個縊蟶群體遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的微衛(wèi)星分析[J].海洋科學(xué), 2013, 37(8),96-102.

[21] Wright S.Evolution in Mendelian population[J].Genetics, 1931, 16: 91-159.

[22] 馬春艷, 馬洪雨, 馬凌波, 等.凡納濱對蝦引進群體和2個養(yǎng)殖群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析[J].海洋漁業(yè),2011, 33(1): 1-8.

[23] 李云霞, 李嬌, 丁君, 等.基于微衛(wèi)星標(biāo)記的刺參群體遺傳結(jié)構(gòu)分析及與經(jīng)濟性狀的相關(guān)性研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報, 2013, 28(5): 438-444.

[24] 湯健, 管云雁, 劉文廣, 等.馬氏珠母貝家系遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星分析[J].海洋科學(xué), 2013, 37(8): 35-41.