李鐵松, 王 穎, 高 楊, 李慶偉

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 遼寧大連 116081)

七鰓鰻(Lampetra japonica)屬無頜脊椎動(dòng)物, 是現(xiàn)存脊椎動(dòng)物中最古老、最原始的物種之一。其化石記錄可以追溯到志留紀(jì)及泥盆紀(jì), 有現(xiàn)存的“活化石”之稱, 被認(rèn)為是進(jìn)化和發(fā)育生物學(xué)研究的新的模式生物, 是研究有頜脊椎動(dòng)物起源和進(jìn)化十分難得的實(shí)驗(yàn)材料。

Prohibitin(PHB)是一種高度保守的蛋白, 廣泛分布于細(xì)菌、植物、酵母、原蟲、果蠅及哺乳類等多種生物細(xì)胞中[1]。目前已知人的 PHB家族包括PHB1和 PHB2, 其結(jié)構(gòu)的保守性和功能的多樣性決定了其參與細(xì)胞的多種生物學(xué)進(jìn)程。研究表明, PHB在細(xì)胞核內(nèi)起負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用[2-5], 抑制細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換和DNA合成[2,6], 從而抑制細(xì)胞增殖。同時(shí),PHB蛋白也可以調(diào)控細(xì)胞凋亡, 且這種凋亡作用具有雙向性, 一方面能夠阻止細(xì)胞的過度增殖, 另一方面又能抵抗細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生[7-11]。 PHB正是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡與分化和調(diào)控激素及其受體活性而發(fā)揮著抗腫瘤作用。

近年來, 陸續(xù)又有研究發(fā)現(xiàn) PHB2與由氧化應(yīng)激因子(活性氧自由基, reactive oxygen species, ROS)作用引起的生物進(jìn)程如衰老、Ⅱ型糖尿病、神經(jīng)退行性疾病及心肌疾病等的改變密切相關(guān)[12]。PHB2在呼吸鏈復(fù)合物亞單位的裝配中充當(dāng)分子伴侶, 參與能量代謝, 起到抗衰老的作用[13]。糖尿病病人體內(nèi)ROS含量和氧化應(yīng)激水平均顯著增高, 引發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)功能紊亂, 而 PHB可起到穩(wěn)定線粒體結(jié)構(gòu)功能的作用。PHB2也存在在人類淋巴細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜上, 不僅僅在保證電子轉(zhuǎn)運(yùn)酶的穩(wěn)定和維持線粒體結(jié)構(gòu)完整性方面起作用, 也參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路, 同時(shí)也可作為細(xì)胞內(nèi) T細(xì)胞活化的重要生物標(biāo)記[12]。PHB2作為PHB家族的重要成員, 它與PHB1相互作用共同構(gòu)成嵌于線粒體內(nèi)膜上的“花環(huán)”復(fù)合體結(jié)構(gòu), 維持細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)功能的穩(wěn)定[13]。

隨著人們對(duì) PHB2在各類生命活動(dòng)發(fā)生、發(fā)展過程中所起重要作用的深入認(rèn)識(shí), 以 PHB2蛋白功能與疾病發(fā)展之間關(guān)系的研究也在不斷增加, 它的功能研究正逐漸被重視并成為熱點(diǎn)。本課題以pMD18-T-Lm-PHB2的克隆載體為模板進(jìn)行前期實(shí)驗(yàn), 后期將Lm-PHB2與含有 His標(biāo)簽的表達(dá)載體pET-32a連接, 以有利于目的蛋白在大腸桿菌內(nèi)以可溶性形式高效表達(dá)并進(jìn)行純化, 為滿足后期該蛋白抗體的制備及其生物學(xué)功能的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

質(zhì)粒pET-32a、表達(dá)菌Rosetta Blue為本實(shí)驗(yàn)室保存, 感受態(tài)細(xì)菌 Rosetta Blue為課題組自己制備,重組質(zhì)粒pMD18-T-Lm-PHB2為本室自己構(gòu)建。

1.2 試劑和藥品

Taq 酶、限制性內(nèi)切酶Hind III、EcoRI、T4-DNA Ligase、DNA Marker、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化試劑盒均購自大連TaKaRa公司; 本實(shí)驗(yàn)所用引物由上海英濰捷基廣州分公司合成; His·Bind Column組氨酸親和層析柱、卡那霉素、IPTG、PVDF膜、Anti-PHB2抗體購自上海生工生物公司; 低分子量蛋白Marker購自大連綠竹生物工程有限公司; 考馬斯亮藍(lán), 瓊脂糖, 瓊脂粉, 蛋白胨, 酵母膏, 氯化鈉,Tris, SDS, 甘油, 溴酚藍(lán), 甲叉雙丙烯酰胺, 丙烯酰胺, Tween 20, 甘氨酸, 甲醇, 醋酸, 乙醇等其他生化藥品為國產(chǎn)分析純。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)為本實(shí)驗(yàn)室博士惠贈(zèng)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù) Ensembl提供的七鰓鰻 PHB2基因序列和課題組前期克隆得到的該基因序列, 按照一般引物設(shè)計(jì)原則和原核表達(dá)載體pET-32a克隆要求, 采用primer 6.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物。正向引物引入HindIII酶切位點(diǎn),反向引物引入EcoRI酶切位點(diǎn), 其序列如下:

Forward(正向引物): 5'- GGAATTCCATGGCTCAGCAGCTCAAGGA-3’

Reverse(反向引物): 5’- CCCAAGCTTGGGCTTCTTTTTCACCGAC-3’

1.4 目的基因的擴(kuò)增

以質(zhì)粒 pMD18-T-Lm-PHB2為模板, 用上述引物擴(kuò)增Lm-PHB2基因編碼序列(CDS區(qū))。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 30個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。

1.5 表達(dá)載體的構(gòu)建

將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和 pET-32a質(zhì)粒用HindIII.和EcoRI進(jìn)行雙酶切, 酶切回收的PCR產(chǎn)物和載體與DNA連接酶混合, 16℃連接6 h, 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài) Rosetta Blue, 篩選單菌落然后提取質(zhì)粒, 進(jìn)行 PCR和酶切鑒定, 將初步鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海生工生物公司進(jìn)行測序。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將帶有重組質(zhì)粒的菌落接種在含有 50 mg/L氨芐氰霉素(Amp)的 LB液體培養(yǎng)基中, 37℃振蕩培養(yǎng)過夜(12~16 h), 次日按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至1 000 mL LB培養(yǎng)基(含 50 mg/L Amp), 37℃培養(yǎng)至 OD600≈0.4~0.6, 加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG, 37℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h, 表達(dá)產(chǎn)物rLm-PHB2經(jīng)12%SDS-PAGE電泳檢測, 并用 Western blotting進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE的分離膠經(jīng)半干電轉(zhuǎn)化使蛋白從膠上全部轉(zhuǎn)移到PVDF膜上, 用預(yù)染彩色Marker作為轉(zhuǎn)移程度的依據(jù), PVDF膜置于封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST) 中37℃封閉, 分別加入一抗兔抗鼠PHB2單克隆抗體(1∶1000)和二抗羊抗兔 IgG(H+L) (1∶5000) 孵育, ECL顯色。

用His·Bind Column組氨酸親和層析柱進(jìn)行純化,純化方法參照說明書進(jìn)行。純化的重組蛋白經(jīng)透析后, 再經(jīng)SDS-PAGE電泳分析得到的目的蛋白rLm-PHB2。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Lm-PHB2基因的擴(kuò)增

以前期構(gòu)建的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增Lm-PHB2基因CDS區(qū), PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 結(jié)果顯示 PCR產(chǎn)物大小約為900 bp, 與Lm-PHB2基因CDS區(qū)序列大小相符(圖1), 表明PCR所擴(kuò)增的片段為目的基因Lm-PHB2的全長CDS區(qū)。

圖1 Lm-PHB2基因 CDS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of Lm-PHB2 gene CDS region

2.2 重組質(zhì)粒pET32a-Lm-PHB2的鑒定

2.2.1 陽性菌落的PCR鑒定

Lm-PHB2基因CDS區(qū)的PCR產(chǎn)物雙酶切后, 插入pET-32a載體中, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)Rosetta blue, 得到數(shù)十個(gè)陽性菌落, 隨機(jī)挑取 1~3個(gè)單菌落進(jìn)行培養(yǎng), 并作PCR初步鑒定, 結(jié)果擴(kuò)增出約900 bp的目標(biāo)片段(圖2),表明Lm-PHB2基因CDS區(qū)已插入pET-32a載體。

圖2 載體pET32a-Lm-PHB2的PCR鑒定Fig.2 Identification of pET32a-Lm-PHB2 by PCR

2.2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

挑取經(jīng) PCR鑒定為陽性克隆的菌落, 挑菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒, 用HindIII和EcoRI進(jìn)行雙酶切鑒定(圖3)。電泳結(jié)果顯示, 與未酶切的質(zhì)粒相比, 質(zhì)粒雙酶切后出現(xiàn)兩個(gè)片段, 小片段分子量約為 900 bp,與Lm-PHB2基因CDS區(qū)的分子量相符; 大片段分子量約為5900 bp, 與線性化的pET-32a大小相符, 進(jìn)一步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 EcoR I和Hind III雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pET-32a-Lm-PHB2 by restriction enzyme digestion

2.2.3 重組質(zhì)粒的測序鑒定

將經(jīng) PCR和酶切鑒定的重組質(zhì)粒 pET-32a-Lm-PHB2送上海生工生物公司測序, 測序結(jié)果與Ensembl提供的海七鰓鰻PHB2基因和課題組前期克隆得到的該基因序列進(jìn)行比對(duì), 結(jié)果表明Lm-PHB2編碼序列正確, 并且沒有發(fā)生移碼突變, 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白rLm-PHB2的表達(dá)及純化

2.3.1 重組蛋白rLm-PHB2的SDS-PAGE分析

含有重組質(zhì)粒的陽性菌落經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示, 在約47 ku處出現(xiàn)融合蛋白條帶(圖4, 如箭頭所示), 與預(yù)期的分子量基本相符。表達(dá)產(chǎn)物存在于裂解菌液上清和沉淀中, 說明重組蛋白 rLm-PHB2在大腸桿菌中可以以可溶蛋白形式表達(dá)。

圖4 SDS-PAGE電泳檢測rLm-PHB2在Rosetta Blue菌中的表達(dá)Fig.4 Expression of rLm-PHB2 in Rosetta Blue tested by SDS-PAGE

2.3.2 重組蛋白rLm-PHB2的純化

誘導(dǎo)表達(dá)得到的 rLm-PHB2重組蛋白用 His·Bind Column組氨酸親和層析柱進(jìn)行純化, 然后用不同濃度的咪唑洗脫層析柱。純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析, 在約47 ku處出現(xiàn)融合蛋白條帶(圖5), 與預(yù)期的分子量基本相符,表明純化得到即為重組蛋白rLm-PHB2。純化后的蛋白經(jīng)透析后, 用考馬斯亮藍(lán)法測得質(zhì)量濃度為210 mg/L。

圖5 rLm-PHB2的洗脫及純化Fig.5 Elution and purification of rLm-PHB2 by His system

2.4 重組蛋白rLm-PHB2的Western Blotting分析

利用兔抗鼠PHB2單克隆抗體(1: 1000)對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行Western blotting鑒定, 結(jié)果表明誘導(dǎo)的蛋白提取液中有目的蛋白的存在(圖6), 重組蛋白正確表達(dá)。

圖6 rLm-PHB2的Western blotting鑒定Fig.6 Identification of rLm-PHB2 by Western blotting

3 討論與結(jié)論

PHB在多種疾病、尤其是腫瘤和退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用, 因此近年來受到越來越多的關(guān)注。Jang等[14]發(fā)現(xiàn)在早期胃癌和肝癌組織中PHB表達(dá)下調(diào)。Gamble等[15]也發(fā)現(xiàn)在雄激素刺激增殖的前列腺癌組織中PHB下調(diào)超過50%。然而在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巢癌等多數(shù)腫瘤的研究中證實(shí)PHB的表達(dá)均顯著上調(diào)[16],推測其原因可能與PHB的磷酸化狀態(tài)、細(xì)胞內(nèi)濃度、細(xì)胞的類型以及腫瘤分期有關(guān)。由于在腫瘤發(fā)生早期 PHB表達(dá)缺陷, 造成了細(xì)胞的過度增生而發(fā)生癌變。隨著腫瘤的發(fā)展, 由于腫瘤細(xì)胞代謝旺盛, 線粒體含量豐富, 進(jìn)而主要在線粒體中表達(dá)的PHB也隨之上調(diào), 可能起到一定的負(fù)反饋?zhàn)饔肹17]。目前認(rèn)為 PHB可以作為腫瘤的早期診斷的一個(gè)標(biāo)志分子[12-13]。對(duì)于糖尿病病人, 有研究證實(shí)檢測到其體內(nèi) ROS含量和氧化應(yīng)激水平均顯著增高, 引發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)功能紊亂,而 PHB可起到穩(wěn)定線粒體結(jié)構(gòu)功能的作用[12-13]。同樣, 在心肌疾病中, 氧化應(yīng)激能造成多種心肌細(xì)胞損傷和凋亡, 并且能引起心肌病、心力衰竭和房顫等[18]。Liu[18]通過給予幼鼠心肌細(xì)胞過氧化氫刺激發(fā)現(xiàn),PHB的表達(dá)量代償性增加, 且PHB定位發(fā)生一定的轉(zhuǎn)移, 從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。并且發(fā)現(xiàn)丹參酮Ⅱ A可以降低在氧化應(yīng)激條件下的PHB的代償性增加, 這可以起到對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用, 并且還會(huì)下調(diào)引起心肌炎癥發(fā)生的一些分子[19-20], 而其中IL6和TNF-a又與mapk通路有關(guān), 并且均能調(diào)節(jié)PHB的表達(dá)[21]。作者的研究也證實(shí)了七鰓鰻PHB在心肌細(xì)胞中具有抗氧化活性。因而在未來PHB可作為抗心肌氧化損傷的藥物靶標(biāo)而得到應(yīng)用。另外,Sripathi[22]等發(fā)現(xiàn)了在過氧化氫刺激的氧化應(yīng)激脅迫下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中PHB定位從線粒體往細(xì)胞核遷移, 作為抗凋亡因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子發(fā)揮功能。這些表明PHB在氧化應(yīng)激脅迫中可以通過定位的變化, 在細(xì)胞核和線粒體及其他細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)中擔(dān)當(dāng)不同的功能分子發(fā)揮不同功能, 從而增強(qiáng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激耐受性。本研究初期擴(kuò)增了七鰓鰻PHB2基因, 并純化出純度較高的rLm-PHB2蛋白, 有利于深入探究七鰓鰻的 rLm-PHB2蛋白在七鰓鰻體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)揮的功能。后期還可以構(gòu)建PHB2的真核過表達(dá)載體, 有助于七鰓鰻 rLm-PHB2蛋白在細(xì)胞水平上的功能初探。

鑒于PHB在腫瘤發(fā)生發(fā)展等病理過程及慢性疾病中的重要作用[13], 本課題組對(duì)PHB家庭成員之一PHB2的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了系統(tǒng)研究, 為了獲得足量可用于體內(nèi)活性研究的蛋白, 作者選擇 pET-32a載體構(gòu)建rLm-PHB2的表達(dá)系統(tǒng), 采用His標(biāo)簽融合表達(dá), 不僅能增加靶蛋白的溶解性和穩(wěn)定性, 還有利于蛋白的進(jìn)一步純化和檢測。在本研究中作者利用pET-32a載體, 成功表達(dá)了可溶性重組蛋白, 并制備了足夠的純度較高的可溶性重組蛋白rLm-PHB2, 為其后續(xù)的相關(guān)功能研究提供了必要基礎(chǔ)。

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