王瑤華, 吳洪喜 , 黃振華 , 陳肖肖 , 胡 園 , 王召根,

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 浙江 溫州 325005; 3.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 溫州 325005)

能源短缺已成為當(dāng)今世界面臨的三大問題(人口膨脹, 環(huán)境污染, 能源短缺)之一。隨著石化能源的日益枯竭, 綠色、清潔生物能的開發(fā)與利用已成為當(dāng)今各國政府和科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)。微藻因具有繁殖速度快、含油量高、單位面積產(chǎn)量高等特點(diǎn)被認(rèn)為是最具替代石化能潛力的新能源之一[1]。目前, 國內(nèi)外許多研究結(jié)果表明, 氮、磷、硅對微藻的繁殖速度和油脂積累有較大的影響[2-5], 但研究的對象主要是綠藻類和浮游硅藻類, 對底棲硅藻的研究還鮮見報(bào)道。本文以溫州洞頭海區(qū)分離出的 2種富油底棲硅藻咖啡雙眉藻(Amphora coffeaeformis)和縊縮菱形藻(Nitzschia constricta)為研究對象, 探討了氮、磷、硅對其繁殖速度和油脂積累的影響, 為底棲硅藻的能源開發(fā)和利用積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 主要材料、儀器及試劑

藻種: 咖啡雙眉藻(Amphora coffeaeformis)、縊縮菱形藻(Nitzschia constricta), 均從洞頭自然海區(qū)中分離所得。

培養(yǎng)容器: 1000 mL錐形瓶。

主要儀器: 熒光分光光度計(jì)(型號: 960CRT, 上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)); 可見分光光度計(jì)(型號: 722型, 上海欣茂儀器有限公司生產(chǎn)); 智能光照培養(yǎng)箱(型號: ZDX-150, 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)); 超聲清洗機(jī)(型號: SB-5200DT, 寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)); 立式壓力蒸汽滅菌器(型號: LDZX型, 上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn))。

主要試劑: NaNO3(分析純); NaH2PO4(分析純);NaSiO3(分析純);尼羅紅(Nile red)(純度≥95%, 生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 藻種的來源

采用水滴法和平板法從溫州洞頭海區(qū)掛板上的藻泥中分離出若干種底棲硅藻, 擴(kuò)大培養(yǎng)后測定其總脂含量, 選定含脂肪較高的咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻為研究對象。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和培養(yǎng)基的制備

N、P、Si分別以f/2培養(yǎng)基為基礎(chǔ), 各設(shè)置5個(gè)質(zhì)量濃度水平, 分別為f/2培養(yǎng)基中相應(yīng)質(zhì)量濃度的1/7、1/5、1/3和9/7, 其他成分不變(表1), 各水平均設(shè)置2個(gè)重復(fù)。配置培養(yǎng)基用的海水取自當(dāng)?shù)睾^(qū),鹽度 30、pH 8.2, 并經(jīng) 0.45μm醋酸纖維膜過濾和120 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

表1 不同N、P、Si質(zhì)量濃度的試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 The experiment design with different concentrations of N, P and Si

1.2.3 尼羅紅染色液的配制

稱9 mg尼羅紅粉末溶于30 mL丙酮, 搖勻, 取1 mL混合液加到2 mL丙酮中, 即得到100μg/mL尼羅紅染色液, 4℃避光保存。

1.2.4 接種與培養(yǎng)管理

取對數(shù)生長期的咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻藻液離心濃縮, 用少量滅菌海水重懸, 取等量藻液分別接入按試驗(yàn)設(shè)計(jì)配置的不同質(zhì)量濃度的 N、P和 Si的培養(yǎng)基中。

控制試驗(yàn)溫度(25±1)℃, 鹽度 30, 藻液不通氣,所有試驗(yàn)均在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行, 光暗比12 h∶12 h。

1.2.5 工作曲線的制定

1.2.5.1 細(xì)胞密度測定工作曲線的制定

取一定量的咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻置于超聲清洗儀中均勻分散, 用可見分光光度計(jì)測定其在 680 nm下的A680(光密度), 并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)出相應(yīng)的藻細(xì)胞密度, 得到A680與藻細(xì)胞密度的關(guān)系(圖1)和線性回歸方程:

圖1 咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻細(xì)胞密度與A680的關(guān)系Fig.1 The quantitative relationship between A680 and cell density of Amphora coffeaeformis and Nitzschia constricta

式中,Y為硅藻細(xì)胞密度(106個(gè)/mL);x為A680值。

兩者具有良好的線性關(guān)系, 本實(shí)驗(yàn) 2種底棲硅藻細(xì)胞密度由測得的A680代入上述相應(yīng)的公式(方程)求得。

1.2.5.2 油脂相對含量測定條件的確定

用熒光分光光度計(jì), 以 485 nm 為激發(fā)光波長,在500~750 nm范圍內(nèi)分別對海水、海水+尼羅紅、藻液、藻液+尼羅紅進(jìn)行掃描, 由于海水自身在這個(gè)范圍內(nèi)沒有自發(fā)熒光, 所以海水的發(fā)射光譜幾乎為一條直線; 海水+NR溶液在650 nm處有1個(gè)峰值,為尼羅紅在水中的自發(fā)熒光, 尼羅紅在水中溶解度很低, 故峰值較小; 藻液和藻液+NR的發(fā)射光譜在680 nm左右都有 1個(gè)峰值, 為葉綠素的發(fā)射峰; 藻液+NR在520~650 nm處出現(xiàn)1個(gè)很高的峰, 對比藻液的發(fā)射光譜, 可以推測出575 nm處為底棲硅藻的脂發(fā)射峰(圖2)。

圖2 海水和藻液及其被尼羅紅染色后的發(fā)射光譜掃描圖Fig.2 Fluorescence emission spectra of seawater and microalgel before and after dyeing

向等體積、同密度的藻液中加入不同質(zhì)量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μg/mL)的尼羅紅,進(jìn)行熒光檢測。結(jié)果顯示尼羅紅在1.0 μg/mL質(zhì)量濃度時(shí)獲到最大的熒光強(qiáng)度, 高于這一質(zhì)量濃度,熒光強(qiáng)度反而下降。取一定量藻液, 稀釋成一定的密度梯度, 染色后檢測其熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示: 當(dāng)A680<0.686時(shí), 藻細(xì)胞密度與相對脂熒光強(qiáng)度的相關(guān)系數(shù)最大。底棲硅藻具有易沉底的特性, 選用偏低的細(xì)胞密度進(jìn)行熒光檢測以減小誤差。

1.2.6 測定方法

1.2.6.1 硅藻藻細(xì)胞密度的測定

隔天將培養(yǎng)容器和藻液在超聲清洗機(jī)中充分震蕩, 均勻分散后, 取 3 mL藻液用分光光度計(jì)測定680 nm處的A680。根據(jù)A680和已經(jīng)求出的工作曲線,計(jì)算出相應(yīng)的硅藻細(xì)胞密度。

1.2.6.2 油脂相對含量的測定

隔天將培養(yǎng)容器和藻液在超聲清洗機(jī)中充分震蕩, 均勻分散后取3 mL藻液測定其在染色前后485 nm激發(fā)波長下 575 nm處的熒光強(qiáng)度(尼羅紅質(zhì)量濃度1μg/mL)。相對熒光強(qiáng)度=熒光強(qiáng)度/細(xì)胞密度; 熒光強(qiáng)度=藻液染色后熒光強(qiáng)度－藻液染色前熒光強(qiáng)度－尼羅紅的自發(fā)熒光強(qiáng)度(均為 575 nm處的熒光強(qiáng)度)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

用 SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 氮對 2種底棲硅藻的繁殖和油脂含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示: NO3-N質(zhì)量濃度為1.746 mg/L時(shí),咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻都幾乎不繁殖, 且藻細(xì)胞從實(shí)驗(yàn)的第7 天開始發(fā)白、衰亡。隨著NO3-N質(zhì)量濃度的升高, 2種底棲硅藻的繁殖速度加快, 但當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到8.820 mg/L后, 再繼續(xù)升高, 2種底棲硅藻的繁殖速度并不明顯加快(圖3和圖4)。從曲線可以看出 2種藻對氮質(zhì)量濃度的適應(yīng)范圍很相似, 只是咖啡雙眉藻對低氮的適應(yīng)力稍強(qiáng)于縊縮菱形藻。方差分析表明: 15d時(shí), 培養(yǎng)液中NO3-N質(zhì)量濃度對2種底棲硅藻繁殖有顯著的影響(P<0.05)。

實(shí)驗(yàn)表明, 不同NO3-N質(zhì)量濃度下, 2種底棲硅藻的油脂含量均呈先降后升, 到指數(shù)生長末期后開始大量積累。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(15d), 藻細(xì)胞油脂含量除質(zhì)量濃度最低組(1.746 mg/L)沒有升高, 甚至降低外,其他組都有所升高, 但質(zhì)量濃度越高, 油脂含量越低(脂熒光強(qiáng)度越低)。15.876 mg/L質(zhì)量濃度組只有5.920 mg/L 質(zhì)量濃度組的一半(圖3和圖4)。第7 天時(shí)顯微觀察顯示, 大部分底棲硅藻細(xì)胞已經(jīng)死亡,但并未解體, 仍有部分油滴被包裹在硅質(zhì)的細(xì)胞壁內(nèi), 所以雖然細(xì)胞密度下降, 其相對熒光強(qiáng)度并未快速下降。方差分析表明: 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí), 培養(yǎng)液中NO3-N質(zhì)量濃度對 2種底棲硅藻油脂含量有顯著影響(P<0.05)。

圖3 不同NO3-N質(zhì)量濃度下咖啡雙眉藻的繁殖曲線和油脂積累比較Fig.3 The growth curves and lipid accumulation of Amphora coffeaeformis under different NO3-N concentrations

圖4 不同NO3-N質(zhì)量濃度下縊縮菱形藻的繁殖曲線和油脂積累比較Fig.4 The growth curves and lipid accumulation of Nitzschia constricta under different NO3-N concentrations

2.2 磷對 2種底棲硅藻的繁殖和油脂含量的影響

結(jié)果顯示, 在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的 H2PO4-P質(zhì)量濃度范圍內(nèi), 2種底棲硅藻均能正常生長, 藻細(xì)胞繁殖速度均隨H2PO4-P質(zhì)量濃度的增高而加快, 但到了較高質(zhì)量濃度(0.884 mg/L)后, 藻細(xì)胞的繁殖速度不再明顯加快, 從生長曲線可以看出, 咖啡雙眉藻較縊縮菱形藻更能適應(yīng)低磷環(huán)境(圖5和圖6), 培養(yǎng)液H2PO4-P質(zhì)量濃度對2種底棲硅藻繁殖有顯著影響(P<0.05)。

圖5 不同H2PO4-P質(zhì)量濃度下咖啡雙眉藻的繁殖曲線和油脂積累Fig.5 The growth curves and lipid accumulation of Amphora coffeaeformis under different H2PO4-P concentrations

隨著H2PO4-P質(zhì)量濃度的增高, 2種底棲硅藻細(xì)胞的油脂含量均呈現(xiàn)先降后升的變化規(guī)律, 且低質(zhì)量濃度的磷更有利于2種底棲硅藻細(xì)胞脂肪的積累。實(shí)驗(yàn)結(jié)束(15 d)時(shí), 咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻細(xì)胞的油脂含量, 低磷質(zhì)量濃度(0.164 mg/L)組分別是最高磷質(zhì)量濃度(1.500 mg/L)組的1.3倍和1.6倍(圖5和圖6), 低質(zhì)量濃度磷對縊縮菱形藻油脂的影響大于咖啡雙眉藻。培養(yǎng)液中H2PO4-P質(zhì)量濃度對2種底棲硅藻油脂含量的影響, 除高于 0.884 mg/L質(zhì)量濃度組外, 其余均呈顯著影響(P<0.05)。

圖6 不同H2PO4-P質(zhì)量濃度下縊縮菱形藻的繁殖曲線和油脂積累Fig.6 The growth curves and lipid accumulation of Nitzschia constricta under different H2PO4-P concentrations

2.3 硅對 2種底棲硅藻的繁殖和油脂積累的影響

硅對 2種硅藻的生長情況影響相似, 在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi), SiO3-Si質(zhì)量濃度對 2種底棲硅藻繁殖速度的影響均隨質(zhì)量濃度的增加而升高(圖7和圖8), 且呈顯著性(P<0.05), 但當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)1.532 mg/L后, 繼續(xù)升高對2種底棲硅藻細(xì)胞繁殖速度的影響變?yōu)椴伙@著(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)后期發(fā)現(xiàn), 低質(zhì)量濃度組硅藻細(xì)胞較高質(zhì)量濃度組硅藻細(xì)胞先老化,可見, 硅有利于硅藻繁殖周期的延長。

硅對2種底棲硅藻油脂積累影響與氮、磷相似,隨著SiO3-Si質(zhì)量濃度的增高, 藻細(xì)胞脂肪含量也呈升高→降低→升高的規(guī)律變化, 較低質(zhì)量濃度的硅(低于0.919 mg/L)更有利于硅藻細(xì)胞油脂的積累。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi), 實(shí)驗(yàn)結(jié)束(15 d)時(shí), 咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻的油脂含量, 最低硅質(zhì)量濃度組(0.307mg/L)分別是最高硅質(zhì)量濃度組(2.758 mg/L)的1.3倍和1.5倍(圖7和圖8), 低質(zhì)量濃度的SiO3-Si更有利于2種底棲硅藻的油脂積累。方差分析表明: 實(shí)驗(yàn)結(jié)束(15d)時(shí), SiO3-Si對2種底棲硅藻油脂含量的影響, 質(zhì)量濃度低于1.532 mg/L影響顯著(P<0.05),質(zhì)量濃度高于1.532 mg/L影響不顯著(P>0.05)。

圖7 不同SiO3-Si質(zhì)量濃度下咖啡雙眉藻的繁殖曲線和油脂積累Fig.7 The growth curves and lipid accumulation of Amphora coffeaeformis under different SiO3-Si concentrations

圖8 不同SiO3-Si質(zhì)量濃度下縊縮菱形藻的繁殖曲線和油脂積累Fig.8 The growth curves and lipid accumulation of Nitzschia constricta under different SiO3-Si concentrations

3 討論

3.1 環(huán)境脅迫可能是促進(jìn)硅藻細(xì)胞積累油脂的直接原因

添加不同質(zhì)量濃度的N、P、Si營養(yǎng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明, 縊縮菱形藻和咖啡雙眉藻的相對油脂含量總體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。前期油脂含量的降低可能是由為硅藻細(xì)胞進(jìn)入新的環(huán)境, 需要一個(gè)適應(yīng)的過程, 到指數(shù)生長期或更遲, 培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)元素, 即將被消耗盡, 于是硅藻細(xì)胞開始積累油脂。N、P和Si越早被消耗完, 硅藻細(xì)胞越早開始積累油脂, 其油脂積累也越多?？梢? 不利的環(huán)境條件, 尤其是營養(yǎng)鹽的缺乏, 更有利于硅藻細(xì)胞油脂的積累。

3.2 氮質(zhì)量濃度對縊縮菱形藻和咖啡雙眉藻的繁殖和油脂含量的影響

N對底棲硅藻繁殖速度的影響已見不少報(bào)道[6-7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 咖啡雙眉藻繁殖適宜的氮質(zhì)量濃度為5.920~8.82 mg/L, 較李雅娟等[6](咖啡雙眉藻最適氮質(zhì)量濃度為2.5~5 mg/L)和王起華等[8](咖啡雙眉藻最適氮質(zhì)量濃度為1.54~6.16 mg/L)的研究結(jié)果高,這可能是由于本實(shí)驗(yàn)的藻種分離于營養(yǎng)鹽較高的海區(qū), 該藻株產(chǎn)生了耐高營養(yǎng)鹽特性; 縊縮菱形藻適宜的氮質(zhì)量濃度為 8.82 ~15.876 mg/L, 較董金利報(bào)道[9]的縊縮菱形藻在>12.35 mg/L才能繁殖要低, 這可能是因?yàn)槎鹄?.23 ~12.35 mg/L區(qū)間內(nèi)沒有設(shè)置實(shí)驗(yàn)組, 影響了實(shí)驗(yàn)精度。氮是構(gòu)成蛋白質(zhì)的必要成分, 在缺氮情況下藻細(xì)胞形成的蛋白質(zhì)量減少,硅藻光合作用形成的能量物質(zhì)有可能更多地轉(zhuǎn)向合成油脂[10]。Chelf[11]認(rèn)為不同的氮源質(zhì)量濃度對油脂積累有很大影響, 且目前普遍認(rèn)為氮缺乏會導(dǎo)致微藻細(xì)胞內(nèi)大量積累油脂[12-13], 本實(shí)驗(yàn)也印證了這一規(guī)律, 培養(yǎng)液中不同氮質(zhì)量濃度對 2種底棲硅藻繁殖和油脂含量的影響均較大, 適當(dāng)降低培養(yǎng)基中氮質(zhì)量濃度有利于油脂的積累。

3.3 磷質(zhì)量濃度對 2種底棲硅藻的繁殖和油脂含量的影響

2種底棲硅藻繁殖速度隨培養(yǎng)基中磷質(zhì)量濃度的增高而加快, 在 0.884~1.500 mg/L范圍內(nèi)均能正常繁殖, 這一現(xiàn)象符合藻類利用磷的特點(diǎn), 大多數(shù)微藻能夠主動(dòng)吸收磷, 當(dāng)環(huán)境磷充足時(shí), 細(xì)胞將吸收的多于生理需要的磷儲存于細(xì)胞內(nèi), 環(huán)境缺磷時(shí)又可利用這些儲存的磷進(jìn)行代謝[14]。一些藻類磷缺乏也能提高其油脂含量, 如三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutumBohlin)、角毛藻(Chaetoceros)、巴夫藻(Pavlova viridis)等; 而另一些藻類磷缺乏反而導(dǎo)致油脂含量的降低, 如屠夫綠球藻(Nannochloris atomus)和融合微藻(Tetraselmissp.)[15]。本實(shí)驗(yàn)的咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻屬于前者, 但磷缺乏較氮缺乏對藻細(xì)胞油脂積累的影響要小。隨著磷質(zhì)量濃度的降低, 藻細(xì)胞中油脂的含量回升越早, 這可能是因?yàn)榈统跏假|(zhì)量濃度的磷可以較早地激活油脂合成途徑。

3.4 硅質(zhì)量濃度對 2種底棲硅藻的繁殖和油脂積累的影響

本實(shí)驗(yàn)中, 硅質(zhì)量濃度在所設(shè)范圍內(nèi), 2種底棲硅藻均能正常繁殖, 但差異較小, 硅質(zhì)量濃度的增加沒有明顯地促進(jìn) 2種底棲硅藻的繁殖, 且低初始硅質(zhì)量濃度對 2個(gè)藻株繁殖的影響沒有低初始氮、磷質(zhì)量濃度的顯著。董金利[9]、馬志珍等[16]、王淵源等[17]報(bào)道在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用自然海水培養(yǎng)底棲硅藻, 即使不加硅鹽仍能良好繁殖。大貝政治等采用營養(yǎng)去除法的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 用不含硅的人工海水培養(yǎng)基培養(yǎng)一種卵形藻時(shí), 對其生長的抑制作用很小。本實(shí)驗(yàn)中低硅質(zhì)量濃度組獲得較高的油脂相對含量, 這是因?yàn)楣枞狈鹩椭铣蛇^程中起作用的乙酰-CoA羧化酶活力的增強(qiáng)[10], 低初始硅質(zhì)量濃度對 2個(gè)藻株繁殖的影響沒有低初始氮、磷質(zhì)量濃度影響的顯著(PN

本實(shí)驗(yàn)僅研究了氮、磷、硅單因子對硅藻細(xì)胞油脂積累的影響, 事實(shí)上營養(yǎng)鹽的配比(主要是氮磷比)對藻類的代謝產(chǎn)物和繁殖速率也有顯著的影響[7,19-20],因此多因子組合對 2種底棲硅藻繁殖速度和油脂積累影響還需要進(jìn)一步深入實(shí)驗(yàn)和探討。

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