朱建立，葉啟霞，趙 陽，權(quán)松霞，溫戰(zhàn)迎，王巨才，何美霞

(1.鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院藥理研究室，河南 鄭州 450052； 2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，河南 鄭州 450052； 3.海南省食品藥品檢驗所，海南 海口 570216)

·實驗研究·

槲皮素二水對多柔比星抗腫瘤的增效及減毒作用研究*

朱建立1，葉啟霞1，趙 陽1，權(quán)松霞2，溫戰(zhàn)迎1，王巨才3，何美霞1

(1.鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院藥理研究室，河南 鄭州 450052； 2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，河南 鄭州 450052； 3.海南省食品藥品檢驗所，海南 ?？?570216)

目的：了解槲皮素二水與多柔比星(doxorubicin，ADM)聯(lián)合用藥后能否增強多柔比星的抗腫瘤作用，并且觀察槲皮素二水能否減低多柔比星對心臟的毒副作用。方法：增效作用采用槲皮素二水不同劑量與多柔比星聯(lián)合用藥，以荷動物移植性腫瘤肝癌(H22)小鼠模型觀察其對小鼠生命延長率的影響，以荷動物移植性肉瘤實體型(S180)小鼠模型來觀察其對抑瘤率的影響；減毒作用研究采用家兔多柔比星心肌損傷模型，觀察槲皮素二水治療后外周血心肌酶譜：肌酸激酶(CK)、CK同工酶MB亞型(CK-MB)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、乳酸脫氫酶(LDH)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的變化。結(jié)果：增效作用顯示槲皮素二水(100 μg/g)合用多柔比星與模型對照組對比，能明顯延長荷H22腹水瘤小鼠的生存時間，并對小鼠S180實體瘤有明顯抑制作用；與單用多柔比星組對比，抑制對荷H22腹水瘤小鼠的生存時間有延長趨勢,S180實體瘤作用顯著增強。減毒作用顯示槲皮素二水治療組與模型對照組對比， CK、CK-MB、CR、 LDH和AST均有降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論： 槲皮素二水與多柔比星聯(lián)合用藥能明顯增強多柔比星對小鼠H22腹水瘤和S180實體瘤的抑制作用，并對多柔比星所致家兔心肌功能損傷有明顯保護作用。

槲皮素二水/藥效學(xué)；多柔比星/藥效學(xué)；腫瘤/藥物作用；增效作用；減毒作用

槲皮素及其衍生物是含有多種生物活性的黃酮類化合物，廣泛存在于植物界，多以苷的形式存在于多種植物的根、莖、葉、果實中，如蕎麥、沙棘、山楂、洋蔥、槐米、三七、銀杏等，其中以槐米含量最高， 4%左右。近年來的研究表明：槲皮素及其衍生物有較強的抗腫瘤作用和較強的心血管保護作用[1-2]。多柔比星(doxorubicin，ADM)抗瘤譜較廣，在臨床上用于多種腫瘤的治療[3-4]，一般作為二線藥物，被認(rèn)為是治療晚期乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)藥物，但其誘導(dǎo)的心肌毒性引起的高死亡率是腫瘤內(nèi)科領(lǐng)域需要研究的重要課題。本研究采用體內(nèi)抗動物移植性腫瘤的實驗方法，研究槲皮素衍生物之一槲皮素二水和ADM聯(lián)合用藥的抗腫瘤作用，以及槲皮素二水對ADM所致心肌毒性的減毒作用，以期為槲皮素及其衍生物更廣泛地應(yīng)用于臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 瘤 株

小鼠移植性腫瘤模型包括肝癌(H22)和肉瘤實體型(S180)，由鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院藥理研究室接種傳代保種。

1.2 動 物

昆明種小鼠，SPF級，雄性，體質(zhì)量18.0～22.0 g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(豫)2005-0001。日本大耳白家兔，普通級，雌雄各半，體質(zhì)量1.7～2.5 kg, 由河南省實驗動物中心提供,許可證號為SCXK(豫)2005-0002。動物飼養(yǎng)溫度為(22±1)℃，12 h人工循環(huán)照明(早8點到晚8點為光照期)，自由攝食、飲水。

1.3 藥品與試劑

槲皮素二水， Sigma公司產(chǎn)品，批號Q0125；注射用鹽酸多柔比星，浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號100501。心肌酶譜檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，批號20101130。

1.4 對小鼠肝癌(H22)生命延長率影響的實驗

將小鼠隨機分為6組，每組動物10只。分別為：模型對照組[生理鹽水0.2mL/(只·d) ip], 單用ADM組[2.0μg /(g·d )ip][5], 單用槲皮素二水低劑量組 [20.0μg /(g·d )ip],槲皮素二水高劑量組[100.0μg /(g·d )ip][6], 槲皮素二水低劑量+ADM組[20.0μg /(g·d )ip +2.0μg /(g·d )ip]；槲皮素二水高劑量+ADM組[100.0μg /(g·d )ip +2.0 μg /(g·d )ip]。無菌抽取生長良好的第10天瘤源鼠腹水，以腹水︰生理鹽水1︰4比例稀釋，0.2 mL/只接種于受試鼠腹腔，次日開始按擬定計量用藥，連續(xù)用藥10 d ,停藥觀察60 d。用藥及停藥觀察期間記錄動物死亡情況，以如下公式計算生命延長率(%)。生命延長率=(給藥組平均存活天數(shù)-模型組平均存活天數(shù))/模型組平均存活天數(shù)×100%。

1.5 對小鼠肉瘤(S180)抑瘤率影響的實驗

實驗分組同上。無菌剝離生長良好的第10天瘤源鼠實體瘤，以腹水︰生理鹽水1∶4比例稀釋制成瘤細胞懸液，按0.2 mL/只接種于受試鼠右側(cè)腋下皮下，次日開始用藥，連續(xù)用藥10d后停藥。停藥后第2天，體外測瘤體體積，計算抑瘤率(%)。抑瘤率=(模型組平均瘤體體積-給藥組平均瘤體體積)/ 模型組平均瘤體體積×100%。剝離瘤體稱量質(zhì)量，計算抑瘤率(%)。抑瘤率=(模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/ 模型組平均瘤重×100%。

1.6 對家兔ADM心肌損傷模型影響的實驗

心肌損傷模型的建立：取家兔12只，每只兔自耳緣靜脈注射ADM 10.0μg/g[7],2周后重復(fù)1次。將模型動物分為模型對照組和槲皮素二水組，每組6只。模型對照組以生理鹽水10.0 mL/兔ip,每周1次， 連續(xù)4周；槲皮素二水組以槲皮素二水藥液100.0 μg/g ip，每周1次，連續(xù)4周。第五周取家兔耳緣靜脈血檢測肌酸激酶(CK)、CK同工酶MB亞型(CK-MB)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、乳酸脫氫酶(LDH)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 對小鼠肝癌(H22)生命延長率的影響

各用藥組與模型對照組對比：單用ADM組、單用槲皮素二水高劑量組、槲皮素二水低劑量+ADM組、高劑量+ADM組小鼠生存時間明顯延長,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與單用ADM組對比：槲皮素二水低劑量+ADM組和高劑量+ADM組小鼠生存時間未見明顯延長，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組肝癌(H22)小鼠生存時間、生命延長率對比 ±s

注：與模型對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 對小鼠肉瘤(S180) 抑瘤率的影響

2.2.1 瘤體體積與抑瘤率

各用藥組與模型對照組對比：單用ADM組、槲皮素二水低劑量+ADM組、高劑量+ADM組呈現(xiàn)明顯抑瘤作用，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與單用ADM組對比：槲皮素二水高劑量+ADM組抑瘤作用呈現(xiàn)明顯增強，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

組 別劑量/(μg·g-1)瘤體體積/cm3抑瘤率/%模型對照組1.13±0.19單用ADM組2.00.74±0.2**34.5單用槲皮素二水低劑量組20.00.99±0.1912.4單用槲皮素二水高劑量組100.00.85±0.2524.8槲皮素二水低劑量+ADM組20.0+2.00.67±0.18**40.7槲皮素二水高劑量+ADM組100.0+2.00.48±0.10**#57.5

注：與模型對照組對比，**P<0.01；與單用ADM組對比，#P<0.05。

2.2.2 瘤體質(zhì)量與抑瘤率

各用藥組與模型對照組對比：單用ADM組、槲皮素二水高劑量組、槲皮素二水低劑量+ADM組、高劑量+ADM組呈現(xiàn)明顯抑瘤作用，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與單用ADM組對比：槲皮素二水高劑量+ADM組抑瘤作用呈現(xiàn)明顯增強，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

組 別劑量/(μg·g-1))瘤體質(zhì)量/g抑瘤率/%模型對照組2.43±0.23單用ADM組2.01.50±0.49**35.8單用槲皮素二水低劑量組20.02.06±0.4015.1單用槲皮素二水高劑量組100.01.71±0.57*29.7槲皮素二水低劑量+ADM組20.0+2.01.41±0.44**42.1槲皮素二水高劑量+ADM組100.0+2.00.98±0.20**#59.8

注：與模型對照組對比，*P<0.05,**P<0.01； 與單用ADM組對比，#P<0.05。

2.3 對家兔ADM心肌損傷的影響

治療組與模型對照組對比：心肌酶譜中CK、CK-MB、LDH和AST各指標(biāo)均明顯下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表4。

組 別CK/(U·L-1)CK-MB/(U·L-1)LDH/(U·L-1)CRP/(mg·L-1)AST/(U·L-1))模型對照組1785.0±229.52788.3±418.7617.3±104.11.45±0.1146.2±9.5槲皮素二水組1029.2±252.4**1995.8±464.3*516.2±82.5*1.43±0.1629.5±7.4*

注：與模型對照組對比，*P<0.05,**P<0.01。

3 討 論

多柔比星是蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，其分子中有脂溶性的蒽環(huán)配基，具有很強的藥理活性[8]。ADM對RNA的抑制作用最強。作為第二線藥物，如何提高其抗腫瘤活性是筆者的研究目標(biāo)之一。另外，ADM使用的累積劑量一旦大于其限制劑量(>550 mg/m2)，由其誘導(dǎo)的心肌損傷就易導(dǎo)致患者心肌壞死，甚至出現(xiàn)充血性心力衰竭而發(fā)生死亡，特別是近年來ADM/PTX(紫衫醇)方案在晚期乳腺癌中的應(yīng)用，心肌毒性反應(yīng)率增加。ADM具有劑量依賴性的心臟毒性的特性限制了其臨床應(yīng)用，因此從中草藥中尋找降低心臟毒性的藥物具有極重要的現(xiàn)實意義。

槲皮素的化學(xué)名為3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮,具有多種生物活性[9-10],如擴張冠狀動脈、降低毛細血管通透性和脆性、抗血小板聚集、抗病毒、抗過敏、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用。近年來,對槲皮素的研究結(jié)果引起了國內(nèi)外學(xué)者越來越多的關(guān)注,特別是在槲皮素抗腫瘤和保護心肌作用方面作了大量的研究，發(fā)現(xiàn)槲皮素能抑制多種腫瘤細胞的增殖,誘導(dǎo)細胞凋亡；能逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥[11]。槲皮素的水溶性較差，而槲皮素二水的水溶性較好，考慮實驗中給藥方式為腹腔注射，故選用槲皮素二水來觀察其藥理活性。本研究發(fā)現(xiàn)：槲皮素二水(100 μg/g)合用ADM，能明顯延長荷H22腹水瘤小鼠的生存天數(shù)，對小鼠S180實體瘤有明顯抑制作用；與單用ADM組對比，抑制S180實體瘤作用顯著增強。有關(guān)槲皮素可增強其他抗腫瘤藥物作用的敏感性已有文獻報道，如槲皮素預(yù)處理的HL60和L1210白血病細胞能增強順鉑誘導(dǎo)的凋亡作用[12]。槲皮素發(fā)揮增效作用可能的機制是:提高腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性；使腫瘤細胞停留在對化療敏感的細胞周期;降低藥物在人體內(nèi)及細胞內(nèi)的降解速度；提高藥物對腫瘤組織的針對性分布及攝取率；提高正常組織對藥物副作用的抵抗力。本研究還發(fā)現(xiàn):槲皮素二水對多柔比星導(dǎo)致的家兔心肌功能損傷有明顯保護作用。文獻報道:槲皮素能從不同角度保護心肌，如預(yù)先用槲皮素孵育體外培養(yǎng)的心肌細胞,可拮抗阿霉素對心肌細胞的損傷[13];槲皮素能防止藥物誘導(dǎo)的大鼠心肌線粒體酶如ATP酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶的變化,并能完全阻止DNR誘導(dǎo)的心肌線粒體外膜熒光的變化[14]。

綜上所述，槲皮素二水對多柔比星抗腫瘤作用有明顯的增效及減毒作用。這為新輔助化療的聯(lián)合用藥進一步研究奠定了一定的基礎(chǔ)，也表明開發(fā)槲皮素具有潛在的社會效益和經(jīng)濟效益。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)11-0066-04

R284

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.11.32

何美霞,研究員,hmx@zzu.edu.cn

河南省公益科研院所預(yù)研項目 (09yy0036)

2015-06-09；

2015-09-09