李志華，李紹鵬，魏春勇，汪禮旭，洪瓊川

(深圳市龍崗中心醫(yī)院胸外科，廣東 深圳 518116)

miRNA在食管鱗癌癌變機(jī)理中的作用研究

李志華，李紹鵬，魏春勇，汪禮旭，洪瓊川

(深圳市龍崗中心醫(yī)院胸外科，廣東 深圳 518116)

目的 通過研究特定miRNA在食管鱗癌組織及正常食管組織中的表達(dá)情況，了解miRNA基因在食管鱗癌癌變機(jī)理中的作用。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)36例食管鱗癌組織和36例正常食管黏膜組織中miRNA-25、miRNA-424、miRNA-151的表達(dá)差異情況。結(jié)果miRNA-25、miRNA-424、miRNA-151在食管鱗癌組織中的含量明顯高于正常食管組織，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論miRNA-25、miRNA-424、miRNA-151在食管鱗癌組織中存在差異表達(dá)，其可能為參與食管癌變的分子機(jī)制之一，并可作為食管癌的分子標(biāo)記物。

miRNA；食管癌；癌基因；分子標(biāo)記

食管癌發(fā)病機(jī)制的研究一直以來是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。最新分子生物學(xué)研究表明，miRNA基因通過干擾mRNA的翻譯而下調(diào)靶基因的表達(dá)，參與許多重要腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，可發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，其表達(dá)失調(diào)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[1]。本課題應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)食管癌組織中的miRNA的表達(dá)，了解miRNA基因在食管癌癌變機(jī)理中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年6月至2014年6月在我院胸外科住院的食管癌患者36例，其中男性29例，女性7例，年齡46～65歲，中位年齡52歲，患者均為初治病例，未行放化療，無其他惡性腫瘤，無心臟病、高血壓、糖尿病、腎病等病史，所有病例均行食管癌根治手術(shù)，取術(shù)中切除的癌組織及正常組織作為標(biāo)本，正常組織為食管上切緣，距腫瘤邊緣大于5 cm且病理檢查無癌細(xì)胞浸潤(rùn)的組織，術(shù)后病理結(jié)果為鱗狀上皮細(xì)胞癌。標(biāo)本作石蠟包埋處理。

1.2 試劑和儀器 實(shí)時(shí)定量使用ABI 7500 PCR儀(美國(guó)AB公司)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒hsa-miRNA-25、hsa-miRNA-424、hsa-miRNA-151和hsa-RNU6(Applied biosystems，美國(guó))；Eppendorf Bio-Photometer核酸定量；石蠟標(biāo)本的提取用Ambion RecoverALLTotal Nucleic試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用相對(duì)定量法，以hsa-RNU6作為內(nèi)參序列，以hsa-miRNA-25、hsa-miRNA-424、hsa-miRNA-151作候選序列分別檢測(cè)石蠟包埋食管癌標(biāo)本、正常食管黏膜組織。

1.3.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 注意清潔，戴一次性的塑料薄膜手套。在提取RNA之前使用RNase(核糖核酸酶)清除液清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)及相關(guān)儀器設(shè)備、處理吸頭。

1.3.2 RNA提取 石蠟包埋組織20 μm厚度切10張白片脫蠟，按石蠟組織試劑盒說明書方法操作并檢測(cè) OD260值，A260/A280比值為1.8～2.1為高純度RNA，核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA濃度，提取總mRNA，洗滌沉淀出mRNA溶解后待用。

1.3.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄 按照TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKALA，日本)的方法，以溶解的總mRNA為模版，加入試劑盒提供的逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP以及反應(yīng)緩沖液，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-40°C低溫下保存待用。

1.3.4 熒光定量PCR 按照美國(guó)Applied biosystems試劑盒說明上的操作方法，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)條件：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，共50個(gè)循環(huán)。在ABI7500熒光定量PCR儀讀出各個(gè)組織達(dá)到熒光閾值所需循環(huán)數(shù)(Ct)值。miRNA-25、miRNA-424、miRNA-151相對(duì)表達(dá)量的MicroRNA分析用U6作內(nèi)參，以2-ΔCt(Ct代表循環(huán)閾值)表示基因表達(dá)量，以食管癌組織組與正常食管組織組相對(duì)表達(dá)量差值為樣本相對(duì)量[2]，公式如下：

ΔCt=[Ct(target gene)-Ct(U6)]食管癌組織-[Ct (target gene)-Ct(U6)]正常食管組織

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件完成數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用配對(duì)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

miRNA-25、miRNA-424、miRNA-151在食管鱗癌組織中的表達(dá)選定合適的熒光信號(hào)閾值后，統(tǒng)計(jì)各組織miRNA-25、miRNA-424、miRNA-151達(dá)到熒光閾值所需循環(huán)數(shù)(Ct)值，計(jì)算出各組織miRNA-25、miRNA-424、miRNA-151的相對(duì)含量。如表1所示，食管鱗癌組織中miRNA-25、miRNA-424、miRNA-151的含量與正常食管組織比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 食管鱗癌和正常食管組織中miRNA-25、miRNA-424、miRNA-151的相對(duì)表達(dá)量(±s)

表1 食管鱗癌和正常食管組織中miRNA-25、miRNA-424、miRNA-151的相對(duì)表達(dá)量(±s)

食管鱗癌組正常食管組t值P值36 36 2.71±0.65 0.58±0.21 3.592 0.002 2.43±0.59 0.46±0.18 3.107 0.005 3.02±0.74 0.71±0.32 4.296 0.001

3 討論

食管癌為胸外科的常見病，男性發(fā)病率高于女性，是目前世界上最常見的六種惡性腫瘤之一。我國(guó)是食管癌高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率達(dá)十萬分之十七，僅次于胃癌，肺癌和肝癌[3]。食管癌變是多種基因變化及多種因素綜合作用的結(jié)果，近年來分子生物學(xué)研究證實(shí)，食管癌的發(fā)生與Rb、p53等抑癌基因失活以及環(huán)境等多因素使原癌基因H-ras、c-myc和hsl-1等激活有關(guān)。microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的有調(diào)控功能的非編碼單鏈RNA家族，長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸，人類基因組編碼了超過1 000個(gè)miRNA，它通過識(shí)別并降解mRNA或者阻止mRNA的翻譯而影響靶基因的表達(dá)。研究表明miRNA在細(xì)胞的增殖和凋亡過程中起多種調(diào)節(jié)作用，參與組織細(xì)胞內(nèi)多種基本信號(hào)的傳導(dǎo)途徑，包括許多與腫瘤發(fā)病密切相關(guān)的基因的調(diào)控表達(dá)。miRNA作為繼蛋白質(zhì)之后又一高效的基因表達(dá)調(diào)控因子，已證實(shí)在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[4]。

食管癌的發(fā)病較隱匿，早期可無癥狀，大多數(shù)患者出現(xiàn)明顯吞咽困難癥狀才發(fā)現(xiàn)。目前的主流治療措施仍然是以手術(shù)治療、化療和放療相結(jié)合的綜合治療方法，但是其治療后五年生存率只有5%～10%，因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是決定食管癌治療效果的關(guān)鍵。研究表明，miRNA在腫瘤發(fā)生過程中起重要作用，類似于癌基因和抑癌基因的作用，miRNA直接參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展，其表達(dá)與食管癌的診斷、分期、進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)[5]。盡管miRNA在食管癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面起著重要作用，但其作用的根本機(jī)制目前尚不清楚。Guo等[6]通過基因芯片技術(shù)分析食管癌及癌旁組織中的miRNA表達(dá)情況，首次探測(cè)到了46種miRNA在冰凍食管癌組織中的表達(dá)明顯區(qū)別于癌旁正常組織。研究結(jié)果顯示至少7種在食管癌組織和正常食管組織中呈差異性表達(dá)，其中miRNA-25和miRNA-130b與癌腫的分化程度有關(guān)，miRNA-7，miRNA-25、miRNA-181d、miRNA-335和miRNA-495與食管癌的大體分型有關(guān)，miRNA-25、miRNA-424在癌組織中的含量明顯高于正常組織，這與本研究結(jié)果相符，說明其在食管癌的發(fā)病過程中起重要作用。

研究表明在腫瘤組織中miRNA通過使異常miRNA沉默使抑癌基因表達(dá)下調(diào)，從而發(fā)揮癌基因作用[7]，miRNA能抑制細(xì)胞凋亡控制細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)?shù)蛲鐾緩奖蛔瓒?，癌基因可以誘導(dǎo)細(xì)胞不受控制地增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。食管癌的發(fā)生發(fā)展在分子水平上涉及眾多原癌基因、抑癌基因以及蛋白質(zhì)的改變。Xu等[8]的研究也發(fā)現(xiàn)miRNA-25在食管鱗癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，miRNA-25過度表達(dá)能促進(jìn)食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲，下調(diào)抑制細(xì)胞的遷移和侵襲，提示其在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。

本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以U6為內(nèi)參對(duì)照定量分析食管癌組織中miRNA-25、miRNA-424、miRNA-151的表達(dá)，結(jié)果表明在食管鱗癌組織中miRNA-25、miRNA-424、miRNA-151的含量較正常食管組織中明顯增加，且差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，腫瘤組織及正常組織中miRNA的表達(dá)有明顯差異，它們的過度表達(dá)發(fā)揮了癌基因的作用，抑制正常食管黏膜細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞失去控制地增殖，最終導(dǎo)致食管癌變。本研究為進(jìn)一步探明miRNA在食管癌變分子機(jī)制中的作用提供了有用的數(shù)據(jù)支持，表明miRNA-25、miRNA-424、miRNA-151可能為參與食管癌變的分子機(jī)制之一，并可作為食管癌的分子標(biāo)記物，對(duì)食管癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷具有積極意義。

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Role of miRNAs in carcinogenesis of esophageal squamous cell carcinoma.

LI Zhi-hua,LI Shao-peng,WEI Chun-yong,WANG Li-xu,HONG Qiong-chuan.
Department of Cardiothoracic Surgery,Longgang District Central Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518116,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo study the differential expression of specific miRNA in esophageal squamous cell carcinoma and normal esophageal tissues,as well as the mechanism of miRNA in esophageal carcinogenesis.MethodsReal-time fluorescent PCR was used to investigate the differential expression of miRNA-25,miRNA-424,miRNA-151 in 36 cases of esophageal squamous cell carcinoma tissues and 36 cases of normal esophageal tissues.ResultsThe levels of miRNA-25,miRNA-424,miRNA-151 in esophageal squamous cell carcinoma tissues were significantly higher than those in normal esophageal tissues(P＜0.01).ConclusionThe levels of miRNA-25,miRNA-424,miRNA-151 have differential expression in esophageal squamous cell carcinoma tissues,which might be one of the molecular mechanisms in esophageal carcinogenesis,and can be used as a molecular marker for esophageal cancer.

miRNA;Esophageal cancer;Cancer gene;Molecular marker

R735.1

A

1003—6350（2015）13—1885—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.13.0679

2014-12-28)

深圳市龍崗區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：YS2012156)

李志華。E-mail：hunter_li@163.com