蔡連鎖，王小敏，劉長江，寧 佳，張岳雯

(樂亭縣醫(yī)院內二科1、藥劑科2，河北 樂亭 063600)

冠心病患者MC4R基因突變與血清ADP、LEP及IL-6的關系及意義

蔡連鎖1，王小敏1，劉長江1，寧 佳2，張岳雯1

(樂亭縣醫(yī)院內二科1、藥劑科2，河北 樂亭 063600)

目的 探討冠心病(CHD)患者黑素皮質素受體4(MC4R)基因rs17782313位點突變與血清瘦素(LEP)、脂聯(lián)素(ADP)、白介素6(IL-6)的關系及臨床意義。方法選取CHD患者416例為觀察組，同期正常體檢者400例為對照組。采用DNA直接測序技術對入組者的MC4R基因rs17782313(T/C)位點多態(tài)性進行檢測，按突變情況分為TT、CT、CC三種基因型。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測各基因型血清LEP、ADP、IL-6水平；檢測兩組的血脂、體質量指數(shù)(BMI)等指標。逐步回歸分析統(tǒng)計MC4R基因rs17782313多態(tài)位點與血清LEP、ADP、IL-6的相關性。結果與對照組比較，觀察組BMI、總膽固醇(TC)、LEP、IL-6水平明顯升高，而高密度脂蛋白(HDL)、ADP降低；觀察組陽性家族史的比例高于對照組(P＜0.05)。觀察組及對照組CC基因型者血清LEP、IL-6水平明顯高于TC、TT基因型者；CC基因型者ADP水平明顯低于TC、TT基因型者(P＜0.05)。逐步回歸分析顯示CHD患者IL-6、LEP水平和MC4R基因rs17782313位點基因突變呈現(xiàn)正相關(r=0.801、0.763，P＜0.05)；觀察組ADP水平和MC4R基因rs17782313位點基因多態(tài)性呈負相關(r=-0.297，P＜0.05)。結論CHD患者血清瘦素、白介素6水平升高，脂聯(lián)素水平降低。MC4R基因rs17782313位點突變可能通過影響血清瘦素、脂聯(lián)素、白介素6水平與CHD的發(fā)生發(fā)展有關。

黑素皮質素4受體基因；基因多態(tài)性；冠心??；瘦素；脂聯(lián)素；白介素6

冠心病(Coronary heart disease，CHD)是我國常見的心臟疾病，危害極大。CHD的發(fā)生與機體脂代謝異常關系密切。脂質沉積可引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌細胞缺血、缺氧或壞死而導致CHD，在臨床上患者發(fā)生心肌梗死、心力衰竭、猝死等嚴重疾病[1-2]。近年來，雖已對CHD進行了許多研究，但該病發(fā)病率、死亡率依然居高不下。目前認為基因突變在CHD的發(fā)生進展中發(fā)揮了重要作用，因而了解與CHD發(fā)病進展相關的基因突變對于CHD綜合診治有重要意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黑素皮質素4受體(Melanocortin-4 receptor，MC4R)基因與CHD有關，該基因的多態(tài)性變化參與了CHD發(fā)生發(fā)展[3]。還有研究證實血清瘦素(Leptin，LEP)、脂聯(lián)素(Adiponectin, ADP)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)在CHD患者出現(xiàn)明顯變化[4-6]。而研究CHD患者MC4R基因rs17782313位點多態(tài)性與ADP、LEP和IL-6關系的報道較少。故本研究分析了CHD患者MC4R基因rs17782313位點多態(tài)性與血清ADP、LEP、IL-6的關系，為闡明CHD的發(fā)病機制提供了一定研究證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年8月至2014年10月在樂亭縣醫(yī)院因CHD就診及正常體檢者。所有入組CHD患者均住院治療，經心電圖、心臟彩超、冠狀動脈造影、冠脈CTA等檢查確診，共416例作為觀察組，其中男性212例，女性204例。CHD診斷標準參照文獻[7]。觀察組患者年齡41～65歲，平均(51.9±8.4)歲。正常體檢者400例為對照組，男女各200例，年齡39～65歲，平均(51.4±9.9)歲。觀察組患者和對照組均無血緣關系；所有入組者均排除感染、腫瘤、嚴重肝腎疾病、其他心臟疾病、免疫代謝類疾?。蝗虢M者均為河北地區(qū)常住漢族人員。入組者均簽署知情同意書，并得到樂亭縣醫(yī)院醫(yī)學Marker(Takara公司)，Mastercycler?gradient PCR儀(Eppendorf公司)，ABI PRISM 377 DNA測序電泳儀(ABI公司)。

1.2 標本收集 研究對象抽取空腹靜脈血4 ml置于EDTA抗凝管，用于提取DNA；另取4 ml分離血清，檢測血脂指標。

1.3 血脂測定 總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)水平用AU680全自動生化分析儀(美國Beckman公司)測定，試劑為日本和光(Wako)純藥工業(yè)株式會社產品。

1.4 血清IL-6、LEP、ADP測定 試劑盒購自美國R&D公司，采用ELISA法檢測，檢測操作按各試劑盒說明書，在德國酶免之星全自動酶免分析儀上測吸光度(A450nm)。

1.5 基因多態(tài)性檢測(直接測序法)

1.5.1 基因組DNA提取 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-K2)抗凝血400 μl按照天根血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)說明書提取基因組DNA，-80℃保存。

1.5.2 PCR擴增MC4R基因片段 引物采用生物學軟件Primer5.0設計，與GenBank進行比對。引物序列：上游5'-AGACAAGTCAAGTGGGTTAC-3'，下游5'-CTGAAAAGAATCTCCCATAC-3'。PCR反應體系20 μl：DNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，KOD plus 0.5 μl，Buffer 2 μl，dNTP Mixture 1 μl，雙蒸水13.5 μl。PCR反應采用降落聚合酶鏈反應技術，所得產物進行特異性檢驗。

1.5.3 核苷酸序列分析 PCR擴增產物純化后雙向測序。測定結果用DNAMAN軟件(V6.0.3.99漢化版)與GenBank公布的MC4R基因序列進行MC4R基因序列比對。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以百分比表示，進行χ2檢驗；多變量逐步回歸分析模型分析MC4R基因rs17782313位點突變與LEP、ADP、IL-6的關系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組受檢者的一般資料和血清IL-6、LEP、ADP水平比較 觀察組TC、身體質量指數(shù)(BMI)、IL-6、LEP的濃度明顯高于對照組，而血清ADP、HDL濃度顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。觀察組家族史的陽性率為40.6%(169/416)，對照組家族史的陽性率為18.25%(73/400)，觀察組家族史的陽性率明顯高于對照組(P＜0.05)。

2.2 MC4R基因rs17782313位點多態(tài)性測序結果 PCR產物雙向測序結果發(fā)現(xiàn)rs17782313位點位點存在等位基因C和T，基因型有TT、CT、CC三種類型，見圖1。

表1 兩組受檢者的一般資料和血清IL-6、LEP、ADP水平比較(±s)

表1 兩組受檢者的一般資料和血清IL-6、LEP、ADP水平比較(±s)

組別觀察組(n=416)對照組(n=400)t/χ2值P值BMI(kg/m2) 25.9±2.46 23.8±2.13 4.15＜0.05 TC(mmol/L) 5.05±1.07 4.64±0.96 2.16＜0.05 TG(mmol/L) 1.37±0.73 1.41±0.69 1.07 0.17 HDL(mmol/L) 1.01±0.37 1.26±0.52 -1.98＜0.05 GLU(mmol/L) 5.35±0.92 5.27±0.86 1.1 0.11 IL-6(pg/ml) 127.1±113.7 10.1±2.4 15.326＜0.01 ADP(mg/L) 4.1±0.32 20.4±1.8 7.295＜0.01 LEP(mg/ml) 74.6±9.3 12.2±1.4 10.417＜0.01

圖1 MC4R基因rs17782313位點多態(tài)性分析的測序結果

2.3 MC4R基因rs17782313位點多態(tài)性與血清IL-6、LEP及ADP水平比較 觀察組中，CC基因型LEP、IL-6的濃度明顯高于TT、TC基因型，ADP的水平顯著低于TT、TC基因型(P＜0.05)。對照組中，CC基因型組LEP、IL-6的濃度明顯高于TT、TC基因型組，ADP的水平顯著低于TT、TC基因型(P＜0.05)。觀察組中，CC、TT、TC各基因型LEP、IL-6的濃度明顯高于正常對照組中相應基因型LEP、IL-6的濃度，CC基因型ADP的濃度顯著低于對照組中相應基因型中ADP的濃度(P＜0.05)，見表2。

表2 兩組受檢者的不同基因型血脂、LP及APN水平比較(±s)

表2 兩組受檢者的不同基因型血脂、LP及APN水平比較(±s)

注：與同一組中TT組比較，aP＜0.05；與同一組中TC組比較，bP＜0.05；與對照組相應基因型比較，cP＜0.05。

組別觀察組(n=416)對照組(n=400)基因型TT TC CC TT TC CC例數(shù)219 140 57 260 121 19 IL-6(pg/ml) 119.6±10.4c131.7±11.8ac153.8±17.2abc8.9±0.9 11.6±1.7a14.7±2.3abADP(mg/L) 4.59±0.37c3.91±0.27ac2.84±0.26abc22.73±1.97 18.01±1.72a13.89±1.36abLEP(mg/ml) 72.9±9.81c75.4±9.17ac80.7±8.9abc11.3±1.7 14.1±1.5a17.4±1.4ab

2.4 多變量逐步回歸分析結果 CHD患者IL-6、LEP水平和MC4R基因rs17782313位點基因多態(tài)性(TT為0，TC為1、CC為2)呈正相關(r=0.801、0.763，P＜0.05)。CHD患者ADP水平和MC4R基因rs17782313位點基因多態(tài)性(TT為0，TC為1、CC為2)呈負相關(r=-0.297，P＜0.05)

3 討 論

CHD是一類由于冠狀動脈粥樣硬化導致的心臟疾病，可導致心絞痛、心梗、心衰等嚴重情況。近年來我國CHD的發(fā)病率、死亡率逐年上升，該病已經成為我國醫(yī)療衛(wèi)生工作重點關注的問題[8]。目前對CHD發(fā)病機制、危險因素及診斷治療的研究已經有了很大進展，但CHD發(fā)病機制復雜，因而病因尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素與CHD發(fā)病有關，在本研究及本課題組前期研究[3]中均發(fā)現(xiàn)CHD患者的家族史陽性率明顯高于對照組，CHD患者血清TC水平升高，HDL水平降低，BMI也高于對照組，且黑素皮質素4受體(MC4R)基因rs17782313位點基因突變與CHD的遺傳易感性密切相關，提示這些可能是CHD的危險因素，與CHD發(fā)病有關，應當予以重視。

人MC4R基因定位于基因組18q22，該基因主要在下丘腦神經細胞中表達，是瘦素介導的食欲調節(jié)途徑中最末端的基因，產生調節(jié)食欲等生理效應。MC4R編碼的蛋白質與體脂肪積累和體重調節(jié)有關。有研究證實MC4R基因突變可導致哺乳動物出現(xiàn)肥胖表現(xiàn)，MC4R基因缺失小鼠同樣有肥胖綜合征表現(xiàn)[9-10]；此外其突變也能導致發(fā)育期少年出現(xiàn)發(fā)病型嚴重肥胖癥[11]。而肥胖者多伴有脂代謝異常，是導致CHD的重要因素。Huang等[12]的研究與本課題組前期研究也證實了這一點。

動脈粥樣硬化(AS)是CHD的基本病理生理改變，是CHD發(fā)生的直接原因。AS作為一種炎癥性疾病，斑塊內伴有大量免疫炎癥細胞的浸潤，可產生多種細胞因子和酶類，使斑塊不穩(wěn)定性增加[13]。炎癥反應在不穩(wěn)定斑塊的發(fā)生、演變過程中具有重要的作用，但有關MC4R基因多態(tài)性與細胞因子之間關系的研究報道極少。故本研究中筆者檢測了MC4R基因rs17782313位點突變與AS關系密切的IL-6、ADP、LEP的關系，為闡明MC4R基因rs17782313位點突變導致CHD這一理論提供依據(jù)。

IL-6是一種多效性細胞因子，廣泛作用于B細胞、T細胞、骨髓造血干細胞、腫瘤細胞等，促進它們分泌活性物質、增殖、分化，增強免疫防御機能，防止血栓形成等。研究證實IL-6與CHD有關，CHD患者IL-6水平明顯升高[14]。Leptin是由脂肪細胞分泌的一種激素樣蛋白質，在調節(jié)機體攝食和能量代謝、分泌代謝、血管新生、生殖、免疫調節(jié)和創(chuàng)傷修復等方面作用顯著。生理水平的Leptin可引起血管舒張，對心肌功能無明顯影響，而病理水平的Leptin可促進大量氧化自由基的產生。研究證實LEP水平的升高與動脈粥樣硬化的進展及CHD的發(fā)生發(fā)展關系密切[15]。ADP是脂肪細胞分泌的一種具有內源性生物活性蛋白質，能改善小鼠的胰島素抵抗和動脈硬化癥；有抗動脈粥樣硬化的作用。研究證實ADP的水平降低可導致CHD[16]。本研究中觀察組的LEP、IL-6明顯高于對照組，ADP明顯低于對照組，提示IL-6、ADP、LEP與CHD關系密切，與上述研究相吻合。

為進一步分析CHD患者MC4R基因rs17782313位點突變與LEP、ADP、IL-6水平之間的關系，本研究比較了觀察組及對照組TT、TC、CC基因型患者組間LEP、ADP、IL-6水平的差異。結果顯示CC基因型者LEP、IL-6水平明顯高于TC及TT者；CC基因型者ADP水平明顯低于TC及TT者。多變量逐步回歸分析結果發(fā)現(xiàn)CHD患者IL-6、LEP、ADP水平和MC4R基因rs17782313位點多態(tài)性均有相關。這些結果均提示MC4R基因rs17782313位點多態(tài)性影響了血清LEP、ADP、IL-6水平。故我們分析MC4R基因rs17782313位點突變可能通過分子調控影響了脂肪細胞因子的水平從而與CHD的發(fā)生發(fā)展有關，但具體機制還有待深入研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)MC4R基因rs17782313位點突變可能是CHD發(fā)生的重要遺傳因素，該突變與血清LEP、ADP、IL-6水平有關，進而推測MC4R基因突變可能通過誘導炎癥細胞釋放多種細胞因子、促進炎癥反應而促進了CHD發(fā)生發(fā)展，但尚需大量工作予以證實。

[1]Zhong Y,Wang N,Xu H,et al.Ischemia-modified albumin in stable coronary atherosclerotic heart disease:clinical diagnosis and risk stratification[J].CoronArtery Dis,2012,23(8):538-541.

[2]Lyu Y,Jiang X,Dai W.The roles of a novel inflammatory neopterin in subjects with coronary atherosclerotic heart disease[J].Int Immunopharmacol,2014,24(2):169-172.

[3]劉長江,王小敏,于 英,等.河北省漢族人群冠心病患者黑素皮質素受體4基因突變的情況及意義[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志, 2014,23(7):699-701.

[4]Zeng R,Xu CH,Xu YN,et al.Association of leptin levels with pathogenetic risk of coronary heart disease and stroke:a meta-analysis[J].Arq Bras Endocrinol Metabol,2014,58(8):817-823.

[5]Wang Y,Zheng A,Yan Y,et al.Association between HMW adiponectin,HMW-total adiponectin ratio and early-onset coronary artery disease in Chinese population[J].Atherosclerosis,2014,235(2): 392-397.

[6]Mahalle N,Garg M,Kulkarni M,et al.Association of inflammatory cytokines with traditional and nontraditional cardiovascular risk factors in indians with known coronary artery disease[J].Ann Med Health Sci Res,2014,4(5):706-712.

[7]陸衛(wèi)紅,吳小慶,王 強,等.麝香保心丸對冠心病患者血管內皮功能的保護作用[J].中國中西醫(yī)結合雜志,2011,31(6):845-846.

[8]郭世杰,王 林,吳存瑾,等.血漿內毒素與冠心病及其危險因素的相關性分析[J].天津醫(yī)科大學學報,2013,19(4):313-315,319.

[9]Pott W,Albayrak O,Hinney A,et al.Successful treatment with atomoxetine of an adolescent boy with attention deficit/hyperactivity disorder,extreme obesity,and reduced melanocortin 4 receptor function[J].Obes Facts,2013,6(1):109-115.

[10]Zlatohlavek L,Vrablik M,Motykova E,et al.FTO and MC4R gene variants determine BMI changes in children after intensive lifestyle intervention[J].Clin Biochem,2013,46(4-5):313-316.

[11]許志遠,宋潔云,王?？?等.FTO和MC4R基因多態(tài)性與代謝綜合征相關性狀的關聯(lián)研究[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2012,39(8): 1866-1870.

[12]Huang H,Zeng Z,Zhang L,et al.Implication of genetic variants near TMEM18,BCDIN3D/FAIM2,and MC4R with coronary artery disease and obesity in Chinese:a angiography-based study[J].Mol Biol Rep,2012,39(2):1739-1744.

[13]Caballero P,Alonso R,Rosado P,et al.Detection of subclinical atherosclerosis in familial hypercholesterolemia using non-invasive imaging modalities[J].Atherosclerosis,2012,222(2):468-472.

[14]Hatzis G,Tousoulis D,Papageorgiou N,et al.Combined effects of smoking and interleukin-6 and C-reactive protein genetic variants on endothelial function,inflammation,thrombosis and incidence of coronary artery disease[J].Int J Cardiol,2014,176(1):254-257.

[15]Akbarpour M.The effect of aerobic training on serum adiponectin and leptin levels and inflammatory markers of coronary heart disease in obese men[J].Biol Sport,2013,30(1):21-27.

[16]Lee S,Kwak HB.Role of adiponectin in metabolic and cardiovascular disease[J].J Exerc Rehabil,2014,10(2):54-59.

Relationship between mutation of MC4R gene and serum leptin,adiponectin and interleukin 6 in patients with coronary heart disease.

CAI Lian-suo1,WANG Xiao-min1,LIU Chang-jiang1,NING Jia2,ZHANG Yue-wen1. 1.Department of Cardiology,2.Department of Pharmacy,People's Hospital of Laoting County,Laoting 063600,Hebei, CHINA

ObjectiveTo explore the relationship and the significance between rs17782313 site polymorphism of melanocortin-4 receptor(MC4R)gene and serum leptin(LEP),adiponectin(ADP)and interleukin-6(IL-6) levels in patients with coronary heart disease(CHD).Methodsrs11084753 site polymorphism of MC4R was detected by DNA sequencing technology in 416 patients with CHD(the study group)and 400 healthy subjects(the control group),which were divided into TT,TC and CC genotypes according to the mutations of rs17782313 site.The levels of serum LEP,ADP,IL-6 were determined by ELISA.The levels of serum lipids and body mass index(BMI)were measured simultaneously.Stepwise multiple regression analysis was applied to explore the correlation between rs17782313 polymorphism of MC4R gene and serum LEP,ADP,IL-6 levels.ResultsThe serum levels of BMI,total cholesterol(TC),LEP,IL-6 in the study group were higher than those in the control group,while the levels of high density lipoprotein(HDL)and ADP were lower(P＜0.05).The levels of LEP,IL-6 were higher,and the level of ADP was lower in the patients with CC genotype than the patients with TC,TT genotype(P＜0.05).Stepwise multiple regression analysis showed that rs17782313 site polymorphism of MC4R was positively correlated with the serum levels of LEP,IL-6 in patients with CHD(r=0.801,0.763,P＜0.05),but negatively correlated with ADP(r=-0.297，P＜0.05).ConclusionPatients with CHD have increased levels of LEP,IL-6 and decreased level of ADP.rs11084753 site polymorphism of MC4R gene is correlated to CHD through affecting LEP,ADP,IL-6.

Melanocortin-4 receptor gene(MC4R);Gene polymorphisms;Coronary heart disease;Leptin; Adiponectin;Interleukin-6

R541.4

A

1003—6350（2015）23—3461—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.23.1255

2015-01-15)

劉長江。E-mail:liuchangjiangdr@126.com