王世強 常蕓 馬曉雯 饒志堅

1 國家體育總局體育科學(xué)研究所（北京，100061）

2 上海體育學(xué)院

長期從事大強度與大運動量訓(xùn)練的運動員， 心房纖顫（房顫）的發(fā)生率明顯高于其他項目運動員[1，2]。 耐力運動員心房纖顫的發(fā)生率在0.3%～12.8%之間[3]。過度增加的膠原蛋白會導(dǎo)致心房纖維化， 造成心房內(nèi)折返形成和電信號傳導(dǎo)異常， 成為誘導(dǎo)心房纖顫的病理基礎(chǔ)[4]。 最近，發(fā)表在Nature Communications上的文章發(fā)現(xiàn)，6周的大強度游泳和跑臺運動造成了小鼠心房纖維化，此為心房纖顫易感性增加的重要原因[5]。

心房纖維化是指心房中的膠原蛋白異常增加的現(xiàn)象。過度增加的膠原蛋白影響心肌細(xì)胞的電信號傳導(dǎo)，促使心房纖顫發(fā)生與維持。 Ⅰ型膠原蛋白（collagen I，Col-I）和Ⅲ型膠原蛋白（collagen Ⅲ，Col-III）是心肌組織中主要的膠原蛋白：Col-I占85%，形成粗纖維，抗拉力性強；Col-III占11%，形成細(xì)纖維，抗張性強。 文獻(xiàn)多報道運動對心室膠原蛋白的影響， 而少見不同強度的運動對心房膠原蛋白的影響[6]。結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF） 可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，對膠原蛋白的合成和沉積具有正向調(diào)節(jié)作用， 參與了心房纖維化及心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)進(jìn)程[7]。不同強度運動對心房Col-I和Col-III表達(dá)的影響以及與CTGF的關(guān)系如何，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。 本研究采用免疫熒光化學(xué)、RTPCR和Western Blot技術(shù)， 觀察不同強度耐力運動后心房Col-I、Col-III和CTGF的變化， 探討不同強度運動對心房膠原蛋白、CTGF表達(dá)的影響及其關(guān)系， 為進(jìn)一步研究運動性心房纖顫的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

8周齡SPF級健康雄性SD大鼠24只，體重為220 ± 8 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXX（京）2012-0001。 所有大鼠均以嚙齒類動物普通飼料喂養(yǎng)， 在國家體育總局體育科學(xué)研究所ABSL-3級動物房飼養(yǎng)， 室溫為22 ± 2℃， 空氣濕度為45% ± 5%，每天光照12小時。

1.2 分組和運動方案

適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，所有大鼠進(jìn)行一周適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，每天訓(xùn)練15 min，跑臺速度為15 m/min、坡度為0°。 后隨機(jī)分為安靜組、中強度組和大強度組，每組8只。安靜組普通飼料喂養(yǎng)至取材。中強度組和大強度組運動訓(xùn)練16周，每周運動5天，休息2天，一次運動持續(xù)1小時。 運動強度方案參照Bedford的研究[8]，中強度組跑臺速度為15.2 m/min、 坡度為5°（相當(dāng)于58.4% ± 1.7%VO2max運動負(fù)荷強度）； 大強度組跑臺速度為28 m/min、 坡度為10°（相當(dāng)于81.00% ± 3.5%VO2max運動負(fù)荷強度），且每次運動前，先以15 m/min速度跑5 min，隨后在5 min內(nèi)逐漸增至28 m/min。

1.3 取材

大鼠運動16周后24小時內(nèi)進(jìn)行取材。 迅速取出心臟，切取右心房，每塊組織分為3份，其中一份以O(shè)CT包埋劑包埋用于做冰凍切片，另兩份放入-80℃冰箱分別用于做RT-PCR和Western Blot。

1.4 RT-PCR檢測CoI、CoⅢ和CTGF mRNA的表達(dá)

采用Trizol法提取總RNA， 每個樣本按照2 μgRNA作為初始模板，配置20 μl的總反應(yīng)體系，應(yīng)用cDNA合成試劑盒（High Capacity RNA-to-cDNA Kit，美國ABI）在核酸擴(kuò)增儀（Gene Amp PCR System 9700，美國ABI公司）中反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 以合成的cDNA作為模板，以β-actin作為內(nèi)參，配置20μl反應(yīng)體系，每個樣本檢測3個復(fù)孔，在實時熒光定量PCR系統(tǒng)（7300，美國ABI）中進(jìn)行擴(kuò)增熒光定量，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃30 s，PCR反應(yīng)95℃5 s，60℃31 s，40個循環(huán)。 熒光定量試劑盒為TaKaRa公司的RR820A。 根據(jù)收集的數(shù)據(jù)通過2-△△CT公式計算樣本中mRNA的相對含量， 其中△△CT=（CT實驗組目的基因-CT實驗組內(nèi)參基因）-（CT對照組目的基因-CT對照組內(nèi)參基因）。 實驗所需引物由上海生工生物合成（表1）。

表1 基因引物序列

1.5 免疫熒光檢測Col-I、Col-Ⅲ的蛋白表達(dá)

冰凍切片入丙酮固定后PBS沖洗，山羊血清封閉30分鐘，滴加一抗（兔抗Col-I、Col-III，1∶1000，購于美國Abcam公司）后4℃過夜，PBS沖洗后滴加FITC標(biāo)記的二抗（1∶200，購于美國Abcam公司），PBS沖洗后甘油封片，200倍鏡檢。樣本進(jìn)行縱切，在相同拍攝條件下攝取，每個樣本隨機(jī)攝取4張圖像， 采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件對目標(biāo)蛋白熒光強度進(jìn)行定量， 以陰性對照樣本中的熒光強度作為參照， 熒光強度用積分光密度（integrated optical density，IOD）表示。

1.6 Western Blot法檢測心房CTGF蛋白的表達(dá)

提取總蛋白后用BCA法測定并調(diào)整蛋白濃度一致，加入上樣緩沖液沸水中10 min使蛋白變性。120V恒壓SDS-PAGE電泳1 h后，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h。 5%脫脂奶粉（購于美國BD公司）封閉1 h，一抗（兔抗鼠Anti-CTGF，稀釋比例為1∶1000，購于美國Abcam公司）置于搖床4℃過夜。 TBST洗滌3次后，加HRP標(biāo)記的二抗（1：5000，購于北京欣博盛公司），室溫?fù)u床孵育1h。TBST洗膜3次，滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑（購于美國Millipore），室溫2 min，濾紙吸干后置于保鮮膜內(nèi)封存，置于暗匣內(nèi)，X光片曝光約1～5 min，顯影液中顯影2 min，定影數(shù)十秒，條帶用Quantity One軟件進(jìn)行圖像分析。 內(nèi)參為βactin（購于美國Abcam公司），計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的IOD。

圖1 大鼠心房Col-I和Col-III的mRNA表達(dá)

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)用GraghPad Prism 6.0軟件轉(zhuǎn)換作圖。 所有數(shù)據(jù)均用SPSS18.0進(jìn)行分析處理，結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心房Col-I和Col-Ⅲ的mRNA表達(dá)

如圖1A所示，16周中等強度和大強度運動都促進(jìn)了大鼠心房Col-I mRNA的表達(dá)。 與安靜組相比， 中強度組Col-I mRNA的表達(dá)增加了84%，而大強度組Col-I mRNA的表達(dá)升高了4.19倍（P<0.05）。

如圖1B所示，16周大強度運動促進(jìn)了大鼠心房Col-III mRNA的表達(dá)增加，較安靜組增加7%，無顯著性差異。 中強度組心房Col-III mRNA的表達(dá)較安靜組降低了52%（P<0.01）， 與大強度組相比具有顯著性差異（P<0.01）。

2.2 大鼠心房Col-I和Col-Ⅲ的蛋白表達(dá)

免疫熒光結(jié)果如圖2所示，Col-I和Col-III的陽性染色為綠色，主要在細(xì)胞間質(zhì)中表達(dá)。 IOD統(tǒng)計分析顯示（圖3），兩種強度運動都促進(jìn)了Col-I的蛋白表達(dá)。 與安靜組相比，中強度組Col-I的表達(dá)增加25%，無顯著性差異，而大強度組增加2.33倍（P<0.01）。與安靜組相比，大強度運動組Col-III的蛋白表達(dá)增加了68%（P<0.01），中強度組略減少11%，無顯著性差異。 中強度組Col-III的表達(dá)也顯著低于大強度組 （P<0.01）。 通過計算Col-I/Col-III的比值發(fā)現(xiàn)，與安靜組相比，中強度組Col-I/Col-III的比值略增加，無顯著性差異。 大強度組Col-I/Col-III的比值顯著高于安靜組和中強度組（P<0.01）。

2.3 大鼠心房CTGF的基因和蛋白表達(dá)

如圖4A所示，中強度組和大強度組CTGF mRNA的表達(dá)均高于安靜組。 其中， 與安靜組相比， 中強度組CTGF mRNA的表達(dá)增加25%，無顯著性差異；大強度組CTGF mRNA的表達(dá)增加37%（P＜0.05）。

如圖4B所示，與安靜組相比，中強度組CTGF的蛋白表達(dá)略有降低， 無顯著性差異。 大強度組大鼠心房CTGF蛋白表達(dá)顯著高于對照組（P＜0.05） 和中強度組（P＜0.01），分別增加22%和30%。

圖2 大鼠心房Col-I和Col-III免疫熒光染色結(jié)果（×200）

3 討論

耐力項目運動員和從事過大強度與大運動量訓(xùn)練的運動員可出現(xiàn)嚴(yán)重的心律失常， 甚至發(fā)生運動性猝死，其中，心房纖顫和心房撲動的發(fā)生率較為顯著[9，10]。約有0.3%～12.8%的運動員存在心房纖顫， 不同項目的運動員心房纖顫的發(fā)生率不同： 年輕耐力運動員心房纖顫的發(fā)生率較低，而45～65歲之間的耐力運動員心房纖顫的檢出率較高[3]。 Elosua等[11]指出一生中總的運動時間累積超過1500小時，心房纖顫的易感性顯著增加。Mystad等[12]對3545名越野滑雪運動員進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，12.5%的調(diào)查對象存在心房纖顫， 心房纖顫的發(fā)生率和累積運動時間成正相關(guān)。 最近，袁斗等[13]證實長期高強度的跑臺運動訓(xùn)練可使兔心房內(nèi)徑增加， 房顫的誘發(fā)率增加。 長期反復(fù)大強度運動導(dǎo)致心肌炎癥的持續(xù)存在和累積損傷，誘發(fā)心肌纖維化，可能是運動性心律失常發(fā)生的重要病理機(jī)制。 Guasch等[14]研究發(fā)現(xiàn)，16周每天進(jìn)行1小時大強度跑臺訓(xùn)練，大鼠心房纖顫的易感性較安靜組顯著增加（64% vs 15%）；天狼星紅染色發(fā)現(xiàn)心房纖維化程度增加了60%， 顯著高于安靜組。 Aschar-Sobbi等[5]研究證實，6周的大強度游泳和跑臺運動造成了小鼠心房纖維化，心房纖顫的易感性增加，而心室則未發(fā)生纖維化。

圖3 大鼠心房Col-I、Col-III的蛋白表達(dá)及其比值

圖4 大鼠心房CTGF mRNA和蛋白表達(dá)

Spach等[15]研究證實，心房纖顫的發(fā)生隨心房纖維化程度的增加而增加， 表明心房纖維化是心房纖顫發(fā)生和維持的重要因素之一。 我們前期實驗通過天狼星紅染色計算膠原容積分?jǐn)?shù)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)12周和16周的大強度運動造成了大鼠心房纖維化形成[16]。 心房纖顫病人Col-I mRNA的表達(dá)顯著增加，Col-I/Col-III的比值顯著升高[17]。Lofsjogard[18]研究發(fā)現(xiàn)心臟衰竭伴隨心房纖顫的病人I 型前膠原羧基端肽（PICP）顯著升高，表明Col-I的合成增加與心房纖顫的發(fā)生和維持具有一定的相關(guān)性。 王友華等[19]研究發(fā)現(xiàn)證實有氧訓(xùn)練可適度促進(jìn)大鼠心室膠原纖維增生， 而過度訓(xùn)練則導(dǎo)致心室膠原纖維過度增加。 本研究發(fā)現(xiàn)，16周大強度運動促進(jìn)了大鼠心房Col-I和Col-III mRNA和蛋白的顯著表達(dá)， 通過計算發(fā)現(xiàn)Col-I/Col-III蛋白的比值顯著增加；16周的中等強度運動則促進(jìn)了Col-I的表達(dá)，但無顯著性差異。相比安靜組，中強度組Col-III mRNA的表達(dá)顯著降低，而Col-III蛋白無明顯變化，Col-I/Col-III蛋白的比值略有降低，但無顯著性差異。 與本研究結(jié)果一致，王友華等[20]研究發(fā)現(xiàn)長期疲勞訓(xùn)練造成大鼠房室結(jié)Col-I表達(dá)顯著增加，Col-I/Col-III的比值升高。 據(jù)此推測，長期大強度運動造成過度增加的膠原蛋白可造成心房內(nèi)電傳導(dǎo)障礙，是誘發(fā)心房纖顫的重要機(jī)制。

心房纖顫和心肌纖維化的發(fā)生與CTGF有關(guān)[21]。CTGF是一種富含半胱氨酸的分泌肽，廣泛存在于多種組織器官中，成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均可分泌CTGF。CTGF參與調(diào)節(jié)多種組織器官纖維化的發(fā)生發(fā)展，是最重要的促纖維化因子之一，在調(diào)節(jié)膠原蛋白的合成過程中具有重要作用。 CTGF可能通過促進(jìn)心肌纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)其分化為心肌成纖維細(xì)胞，使ECM的合成增加，誘導(dǎo)心肌纖維化。 體內(nèi)注射CTGF抑制劑8周后發(fā)現(xiàn)， 大鼠Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)顯著減少，心肌纖維化程度降低[22]。CTGF是心房纖顫發(fā)生和維持的重要因素，Li等[7]證實慢性心房纖顫病人右心房伴隨明顯的間質(zhì)纖維化，CTGF mRNA和蛋白的含量顯著高于正常對照組，且與膠原容積分?jǐn)?shù)（Collagen Vomume Fraction，CVF）正相關(guān)。Adam等[23]則指出，心房纖顫病人左心房伴隨間質(zhì)纖維化，同時存在CTGF的高表達(dá)。 動物研究證實，采用siRNA干擾抑制CTGF后，膠原蛋白的含量顯著降低，小鼠心房纖維化的程度降低。 因此，有研究提出，可以將血清CTGF的水平作為心房纖顫程度和心房纖顫消融手術(shù)預(yù)后的標(biāo)志物[24，25]。

本研究發(fā)現(xiàn)，16周大強度運動顯著促進(jìn)了大鼠心房CTGF mRNA和蛋白的表達(dá)。 中強度組CTGF mRNA的表達(dá)較安靜組雖也有升高趨勢， 但蛋白的表達(dá)具有降低趨勢， 這可能是轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過基因調(diào)控和修飾的結(jié)果。CTGF的激活主要受血管緊張素II（AngII）的調(diào)節(jié)[26]。研究已經(jīng)證實，AngII可以上調(diào)TGF-β1的和CTGF表達(dá)，同時CTGF還受TGF-β1的正向調(diào)控[27]。過度訓(xùn)練可造成心肌局部和循環(huán)中AngII的顯著增加[28]，使用抑制AngII的藥物氯沙坦可緩解過度運動造成的心肌纖維化[6，29]。本研究結(jié)果16周大強度運動誘導(dǎo)Col-I、Col-III含量和Col-I/Col-III比值的增加的原因可能是，過度運動造成心肌AngII和TGF-β1高表達(dá)， 正向調(diào)控下游調(diào)控因子CTGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)心肌組織中成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白的分泌，誘導(dǎo)心房纖維化的形成，參與心房纖顫的形成和維持。

4 小結(jié)

（1） 長期中等強度運動對心房Col-I和Col-III的影響不顯著，而長期大強度耐力運動導(dǎo)致大鼠心房Col-I、Col-III的蛋白表達(dá)和Col-I/Col-III的比值顯著增加，提示過度表達(dá)的膠原蛋白可能是心房發(fā)生纖維化的重要病理改變。

（2）長期中等強度運動對心房CTGF的表達(dá)無明顯影響，而長期大強度耐力運動可導(dǎo)致大鼠心房CTGF表達(dá)增加，這可能與Col-I、Col-III含量增加、Col-I/Col-III比例升高有關(guān)， 可能是運動性心房纖顫發(fā)生的重要機(jī)制之一。

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