李 強(qiáng)，靳書濱，李 峰，霍韶軍，張瑞剛

(邯鄲市中心醫(yī)院泌尿外科，河北 邯鄲 056001)

刺五加注射液對大鼠腎缺血再灌注損傷的影響

李 強(qiáng)，靳書濱，李 峰，霍韶軍，張瑞剛

(邯鄲市中心醫(yī)院泌尿外科，河北 邯鄲 056001)

目的 探討刺五加(Aeanthopanax senticosus，AS)注射液預(yù)處理對大鼠腎缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury，IRI)的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法于2013年12月至2014年5月，實(shí)驗(yàn)采用單動脈夾閉法構(gòu)建大鼠急性腎IRI模型。選用36只健康雄性SD大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字法，隨機(jī)分為六組，每組6只：(1)對照5 h組(Control 5 h組)；(2)對照10 h組(Control 10 h組)；(3)缺血再灌注損傷5 h組(IRI 5 h組)；(4)缺血再灌注損傷10 h組(IRI 10 h組)；(5)刺五加注射液預(yù)處理后腎缺血再灌注損傷5 h組(AS 5 h)；(6)刺五加注射液預(yù)處理后腎缺血再灌注損傷10 h組(AS 10 h)。Control組術(shù)中僅切除右腎；IRI組及AS組采用切除大鼠右腎，夾閉左側(cè)腎動脈，45min后解除夾閉。AS組于術(shù)前5 d每天給予1次及術(shù)前0.5 h給予1次刺五加注射液，按100 mg/kg腹腔注射；Control組及IRI組術(shù)前5 d及術(shù)前0.5 h給予腹腔注射和AS同等劑量的生理鹽水。各組于相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)采集下腔靜脈血及左腎組織，然后處死各組實(shí)驗(yàn)大鼠，檢測各組大鼠血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)，腎組織超氧化物岐化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量，HE染色光鏡下觀察各組大鼠腎臟組織的病理變化。結(jié)果AS預(yù)處理組腎組織病理變化輕于IRI組；與Control組相比較，IRI組的BUN、Scr水平升高(P＜0.05)，腎組織中的SOD降低及MDA水平增加(P＜0.05)。而AS預(yù)處理組的Scr、BUN和腎組織的MDA均比IRI組低(P＜0.05)，而腎組織中的SOD水平升高(P＜0.05)。結(jié)論AS對腎臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抗氧化作用實(shí)現(xiàn)的。

刺五加注射液；腎缺血再灌注損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛

腎缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury，IRI)在臨床上比較常見。外科常見的是外傷急性失血、術(shù)中失血、心臟驟停、腎部分切除術(shù)、腎移植、腎動脈重建、腎盂積水、腎擠壓傷等，是目前國內(nèi)外研究的重要課題。再灌注損傷發(fā)生時(shí)最重要病理機(jī)制是大量氧自由基的產(chǎn)生，產(chǎn)生的大量自由基通過脂質(zhì)過氧化嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞。研究證明刺五加(Aeanthopanax senticosus，AS)具有良好的抗氧化、清除氧自由基、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能的作用[1-2]。本研究在建立大鼠腎IRI模型的基礎(chǔ)上研究AS對大鼠腎IRI的防治作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 刺五加注射液：黑龍江烏蘇里江制藥廠生產(chǎn)，每支100ml，含總黃酮300 mg。SOD、MDA試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；722分光光度計(jì)產(chǎn)于江蘇無錫柯達(dá)智能儀器廠；電熱恒溫隔水式培育箱產(chǎn)于湖北省黃石市醫(yī)療器械廠；高速低溫離心機(jī)產(chǎn)于Sigma公司；超低溫冰箱產(chǎn)于Forma scientific company。

1.2 動物及分組 本實(shí)驗(yàn)采用單動脈夾閉法構(gòu)建大鼠急性腎缺血再灌注損傷模型。選用36只健康雄性SD大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字法，隨機(jī)分為六組，每組各6只：(1)對照5 h組(Control 5 h組)；(2)對照10 h組(Control 10 h組)；(3)缺血再灌注損傷5 h組(IRI 5 h組)；(4)缺血再灌注損傷10 h組(IRI 10 h組)；(5)AS預(yù)處理后腎缺血再灌注損傷5 h組(AS 5 h組)；(6)AS預(yù)處理后腎缺血再灌注損傷10 h組(AS 10 h組)。

1.3 方法 Control組術(shù)中僅切除右腎；IRI組及AS組采用切除大鼠右腎，夾閉左側(cè)腎動脈，45min后解除夾閉。AS組于術(shù)前5 d每天給予1次及術(shù)前0.5 h給予1次刺AS，按100 mg/kg腹腔注射；Control組及IRI組術(shù)前5 d及術(shù)前0.5 h給予腹腔注射和AS同等劑量的生理鹽水。各組于相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)采集下腔靜脈血及左腎組織，然后處死各組實(shí)驗(yàn)大鼠，檢測各組大鼠血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)，腎組織超氧化物岐化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量；HE染色光鏡下觀察各組大鼠腎臟組織的病理變化，

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 腎組織病理檢查 將甲醛固定后的腎臟組織用乙醇階梯脫水后，二甲苯透明，HE染色，連續(xù)切片，切片厚度為3～4 μm，光學(xué)顯微鏡下觀察，了解腎組織的損傷情況。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)室檢查 (1)Scr、BUN標(biāo)本由邯鄲市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科自動生化分析儀檢測。(2)腎組織勻漿SOD活力、MDA含量按說明書方法測定，組織蛋白測定用雙縮脲法。

2 結(jié)果

2.1 腎組織病理改變 HE染色光鏡下，Control組可見腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)較清楚，形態(tài)基本正常，腎小管上皮細(xì)胞未見明顯腫脹，無變性、壞死，腎間質(zhì)改變和炎性細(xì)胞浸潤不明顯(見圖1)；IRI組病變主要在腎小管，可見到腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，細(xì)胞脫落，炎性細(xì)胞浸潤明顯，部分腎小管可見細(xì)胞碎片，腎間質(zhì)水腫、充血、炎癥細(xì)胞浸潤(見圖2)；而AS組主要病理表現(xiàn)為腎小管變性，細(xì)胞脫落較IRI組減少，腎間質(zhì)水腫、充血、炎性浸潤等病理改變較IRI組明顯減輕(見圖3)。

圖1 Control 5 h組和Control 10 h組的大鼠腎組織病理變化(HE染色×200)

圖2 IRI 5 h組和IRI 10 h組的大鼠腎臟組織病理變化(HE染色×200)

圖3 AS 5 h組和AS 10 h組的大鼠腎臟組織病理變化（HE染色×200）

2.2 各組Scr、BUN水平的變化 由表1可以看出，在5 h時(shí)IRI與Control組比較Scr、BUN均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000、P=0.001)，10 h比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002、P=0.001)。在5 h時(shí)AS組與Control組比較，Scr、BUN均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001、P=0.000)；10 h時(shí)比較發(fā)現(xiàn)Scr、BUN均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000、P= 0.003)。在缺血再灌注5 h時(shí)，AS組與IRI組比較，發(fā)現(xiàn)Scr、BUN明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000、P=0.000)，在10 h時(shí)Scr、BUN也明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000、P=0.001)。從IRI 5 h組和IRI 10 h組相比較結(jié)果來看，IRI 10 h組Scr、BUN明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Scr：t=-5.439，P=0.001；BUN：t=-6.777 2，P=0.000)。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Scr、BUN水平變化(±s)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Scr、BUN水平變化(±s)

注：a表示與Control組同時(shí)比較，P＜0.05；b表示與IRI組同時(shí)比較，P＜0.05；c表示與IRI 5 h組比較，P＜0.05。

組別BUN(mmol/L)例數(shù)Scr(μmol/L) Control 5 h組Control 10 h組IRI 5 h組IRI 10 h組AS 5 h組AS 10 h組3.89±0.29 4.26±038 16.89±1.78a21.4±2.5ac7.51±5.53ab11.54±1.28ab6 6 6 6 6 6 48.42±4.2 46.44±3.9 155.31±15.68a224.26±18.75ac103.39±8.60ab106.51±9.8ab

2.3 各組腎組織MDA、SOD水平的變化 由表2可以看出，在5 h和10 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別比較：IRI組與Control組比較，SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(5 h：P=0.002、P=0.003；10 h：P=0.003、P=0.001)。AS組與Control組比較SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(5 h：P=0.003、P=0.002；10 h：P=0.003、P= 0.002)。AS組與IRI組比較SOD活性升高，MDA含量則下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(5 h：P=0.001、P=0.002；10 h：P=0.000、P=0.002)。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎組織MDA、SOD水平變化(±s)

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎組織MDA、SOD水平變化(±s)

注：a表示與Control組同時(shí)比較，P＜0.05；b表示與IRI組同時(shí)比較，P＜0.05；c表示與IRI 5 h組比較，P＜0.05。

組別MDA(nmol/mg)例數(shù)SOD(U/mg) Control 5 h組Control 10 h組IRI 5 h組IRI 10 h組AS 5 h組AS 10 h組8.08±1.23 7.5±1.45 26.45±3.25a40.32±4.22ac13.16±2.14ab11.38±2.2ab6 6 6 6 6 6 112.7±11.08 125.45±6.35 55.48±6.15a45.61±4.76ac78.24±4.52ab63.78±5.28ab

3 討論

組織細(xì)胞的正常功能，需要良好的血液循環(huán)。各種損傷使組織血液灌注減少后，可使組織細(xì)胞發(fā)生缺血性損傷，及時(shí)恢復(fù)組織血供，是治療缺血性損傷的主要方法。但發(fā)現(xiàn)部分患者恢復(fù)血液再灌注后，細(xì)胞功能及結(jié)構(gòu)破壞反而加重，這種現(xiàn)象稱為缺血-再灌注損傷。其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，目前研究表明它與大量氧自由基的生產(chǎn)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、中性粒細(xì)胞激活、凋亡基因的調(diào)控、內(nèi)皮素等介導(dǎo)的腎小管、腎小球細(xì)胞損傷等具有密切關(guān)系[3]。

病理過程中，氧自由基對組織的氧化損傷起重要作用。由氧誘發(fā)的自由基稱為氧自由基或活性氧，如超氧陰離子、羥自由基及單線態(tài)氧等非脂性自由基。黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，XO)及其前身為黃嘌呤脫氫酶(Xanthine dehydrogenase，XD)，二者主要存在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)。正常時(shí)XD占90%，XO只占10%。組織缺血、缺氧，使ATP減少，膜泵失靈，離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙，Ca2+進(jìn)入細(xì)胞增多，激活鈣依賴性蛋白酶，使XD轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶XO。同時(shí)因缺血缺氧，ATP依次降解為ADP、AMP、腺苷和次黃嘌呤，次黃嘌呤自身不能代謝生成黃嘌呤，使得次黃嘌呤大量蓄積。再灌注時(shí)，隨著血液的進(jìn)入，缺血組織重新得到氧，在缺血時(shí)大量蓄積的次黃嘌呤在XO的作用下形成黃嘌呤，繼而又催化黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸，這兩步反應(yīng)都有電子轉(zhuǎn)移，以分子氧作為電子受體，氧分子可得到電子，生成大量超氧陰離子自由基(氧自由基)。而此時(shí)腎臟內(nèi)的SOD、過氧化氫酶(CAT)等因?yàn)槿毖毖?，清除氧自由基的能力下降。氧自由基大量蓄積，氧自由基和脂性自由基的性質(zhì)極為活潑，易于失去電子(氧化)或奪取電子(還原)，特別是其氧化作用強(qiáng)，故具有強(qiáng)烈的引發(fā)脂質(zhì)過氧化損傷的作用，它最易損傷膜脂質(zhì)，導(dǎo)致鈣泵、鈉泵等膜蛋白功能受到損傷，發(fā)生細(xì)胞腫脹和鈣超載，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生障礙。Araujo等[4]研究證實(shí)，氧自由基在腎IRI中起了非常重要的作用，是腎臟再灌注損傷的重要介質(zhì)。氧化損傷也可使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，Chatterjee等[5]發(fā)現(xiàn)IRI能引發(fā)廣泛的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

國內(nèi)外許多學(xué)者將具有抗氧化作用的藥物應(yīng)用于缺血再灌注損傷的研究。SOD是組織產(chǎn)生的清除氧自由基的重要酶之一，和其他抗氧化劑協(xié)同作用將超氧陰離子歧化為H2O2，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O，從而使得超氧陰離子對生物體細(xì)胞損傷作用消失，起到保護(hù)作用。SOD反映機(jī)體清除氧自由基的能力，是抗氧化指標(biāo)之一。MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物。通過檢測MDA含量可以估計(jì)腎組織中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的強(qiáng)弱。

刺五加注射液是純天然五加科植物刺五加的莖葉經(jīng)水醇法提取，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)精制而成，主要成分為總黃酮，能擴(kuò)張血管，降低血液粘稠度[6]，促進(jìn)血液循環(huán)，減少組織耗氧量和組織代謝，有抗疲勞、抗應(yīng)激、抗炎[7]作用，能清除氧自由基及提高人體超氧化物歧化酶活性及清除氧自由基的能力。很多動物實(shí)驗(yàn)研究表明，刺五加注射液對缺血再灌注的心臟、腦、肝臟、腸、肢體均具有保護(hù)作用[8-10]，其作用機(jī)制與其清除氧自由基、防止脂質(zhì)過氧化有關(guān)。其用于腎臟缺血再灌注損傷的研究尚無報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果：從IRI 5 h組和IRI 10 h組相比較結(jié)果可見，大鼠腎IRI模型建立后，腎功能發(fā)生明顯障礙，而且在早期的一段時(shí)間內(nèi)(5 h、10 h)，BUN、Scr逐漸升高，腎功能障礙逐漸加重。從AS組、IRI組分別與Control組相比較結(jié)果可見，BUN、Scr均明顯升高，說明造模較成功，AS組、IRI組大鼠腎功能均發(fā)生明顯障礙。進(jìn)一步看AS組與IRI組相比較的結(jié)果，AS組BUN、Scr均降低，可見AS預(yù)處理可使大鼠腎IRI后腎功能明顯改善，起到保護(hù)作用。HE染色可見Control組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，無水腫、炎細(xì)胞浸潤、細(xì)胞變性、管腔狹窄等病理改變；IRI組出現(xiàn)明顯病理改變，其腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)變化不明顯，病變主要集中在腎小管，可見到腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，細(xì)胞脫落，炎性細(xì)胞浸潤明顯，部分腎小管可見細(xì)胞碎片，腎間質(zhì)水腫、充血、炎癥細(xì)胞浸潤，說明造模后由于IRI導(dǎo)致大鼠腎臟出現(xiàn)明顯病理改變；而AS組主要病理表現(xiàn)為腎小管變性，細(xì)胞脫落較IRI組減少，腎間質(zhì)水腫、充血、炎性浸潤等病理改變較IRI組明顯減輕，考慮AS預(yù)處理對缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，病理改變明顯減輕。從AS組、IRI組分別與Control組相比較結(jié)果可見：大鼠腎組織的MDA水平均明顯升高，而SOD活性均明顯降低，提示大鼠腎IRI后脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，內(nèi)源性自身抗氧化能力減弱。而從AS組與IRI組相比較結(jié)果可見：AS組較IRI組MDA水平明顯降低，SOD活性顯著升高，可看出組織抗氧化能力提高，氧化損傷反應(yīng)減輕。

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，我們考慮AS預(yù)處理可對大鼠腎缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，其機(jī)理可能與其有抗氧化作用，能提高細(xì)胞的抗氧化能力，減輕氧自由基大量釋放導(dǎo)致的組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而產(chǎn)生保護(hù)作用。由于缺血再灌注損傷病理機(jī)制極其復(fù)雜，AS預(yù)處理對于其的保護(hù)作用，還需要進(jìn)一步、多方面試驗(yàn)進(jìn)行觀察。

[1]劉文闖,劉春明,陸 娟,等.刺五加葉中總黃酮的分離提取及抗氧化活性研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2009,38(8):1622-1625.

[2]Sparg SG,Light ME,Staden JV.Biological activities and distribution of plant saponins[J].J Ethnopharm,2004,94:219-243.

[3]Ramesh G,Reeves WB.Inflammatory cytokines in acute renal failure[J].Kinney Int,2004,91(Suppl):56-62.

[4]Araujo M,Welch WJ.Oxidative stress and nitric oxide in kidney function[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2006,15(1):72-77.

[5]Chatterjee PK,Brown PA,Cuzzocrea S,et al.Calpain inhibitor reduces renal ischemia reperfusion injury in the rat[J].Kidney International,2001,59(6):2073-2083.

[6]韓曉東.刺五加注射液對急性血淤模型大鼠血液流變學(xué)的影響[J].中國實(shí)用醫(yī)藥,2009,4(36):45-47.

[7]Lee YJ,Chung HY,Kwak HK,et al.The effects of A senticosus supplementation on serum lipid profiles,biomarkers of oxidative stress, and lymphocyte DNA damage in postmenopausal women[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,375(1):44-48.

[8]何化林,羅 維,劉偉新,等.刺五加注射液對腸缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2005,28(6):5-6.

[9]劉天丹,黃良國,王鳳英,等.刺五加注射液對腦出血大鼠血腫周圍組織含水量、SOD、MDA水平的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2009,7(9):1055-1057.

[10]王瑞國,黎萬友,張延明,等.刺五加注射液對肢體缺血再灌注損傷的影響[J].中醫(yī)正骨,2005,17(3):9-11.

Effect of Aeanthopanax senticosus pretreatment on acute renal ischemia-reperfusion injury in rats.

LI Qiang, JIN Shu-bin,LI Feng,HUO Shao-jun,ZHANG Rui-gang.Department of Urology,Handan Central Hospital,Handan 056001,Hebei,CHINA

ObjectiveTo observe the protective effect of Aeanthopanax senticosus(AS)and discuss its possible mechanism on rats with acute renal ischemic reperfusion injury(IRI).MethodsRats with acute renal ischemia reperfusion injury model were constructed by single-artery occlusion.Thirty-six healthy male SD rats were selected and randomly divided into six groups:Control 5 h group,Control 10 h group,IRI 5 h group,IRI 10 h group,AS 5 h group,AS 10 h group.In Control group,right kidney was removed.In IRI and AS group,right kidney was removed, and the left renal was occlusived for 45minutes.AS 5 h group,AS group rats were injected 100 mg/kg AS intraperitoneally once per day in the 5 days before surgery and 30minutes before surgery.Control group and IRI group rats were injected saline at the equivalent dose at the same time.Venous blood and left kidney tissue were taken at corresponding time point(5 h and 10 h)in each group.The levels of Scr and BUN were measured,as well as SOD and MDA activity of kidney tissue.Pathological changes of renal tissue were observed by H-E staining technique.ResultsPathological changes of renal tissue were lighter in AS group than IRI group.Compared with Control group,BUN,Scr levels in IRI were significantly increased(P＜0.05),with SOD decreased and MDA increased(P＜0.05).Compared with IRI group,Scr,BUN,MDA in AS group were significantly lower(P＜0.05).ConclusionAeanthopanax senticosus could protect the kidney against renal ischemia reperfusion injury,which might be realized by its antioxidant.

Aeanthopanax senticosus;Renal ischemia reperfusion injury;Superoxide dismutase;Malondialdehyde

R-332

A

1003—6350（2015）04—0475—04

2014-08-13)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.04.0174

李 強(qiáng)。E-mail：xinghuoliqiang@163.com