李小寧，賀豐杰，吉 喆

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，陜西 咸陽 712021；2.西安西電集團(tuán)醫(yī)院婦科，陜西 西安 710077)

中藥“鳳香洗液”對伴HPV感染的CIN患者宮頸局部IL-2和IL-4的影響

李小寧1，賀豐杰1，吉 喆2

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，陜西 咸陽 712021；2.西安西電集團(tuán)醫(yī)院婦科，陜西 西安 710077)

目的 觀察中藥“鳳香洗液”對伴有HPV感染的CINⅠ、CINⅡ患者陰道局部免疫狀態(tài)的影響及治療效果。方法選取2013年7月至2015年2月于陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、西安西電集團(tuán)醫(yī)院門診就診，經(jīng)陰道鏡下宮頸活檢病理證實為CINⅠ、CINⅡ且伴有高危型HPV感染的患者共60例，其中CINⅠ30例，CINⅡ30例，對照組為同期健康體檢的婦女30例。CINⅠ組接受3個療程的“鳳香洗液”治療。應(yīng)用ELISA方法測定各組人群用藥前后陰道灌洗液輔助性T淋巴細(xì)胞(Th細(xì)胞)1、2細(xì)胞因子水平，其中Thl細(xì)胞因子以白細(xì)胞介素2(IL-2)表示，Th2細(xì)胞因子以IL-4表示。結(jié)果CINⅠ組、CINⅡ組患者陰道灌洗液中IL-2表達(dá)水平顯著低于對照組(P＜0.01)，CINⅠ組、CINⅡ組IL-4表達(dá)水平明顯高于對照組(P＜0.05)，CINⅠ組、CINⅡ組患者IL-2/IL-4比值明顯低于對照組(P＜0.05)，且這些變化在CINⅡ組較CINⅠ組更明顯(P＜0.05)；CINⅠ組在用藥后IL-2水平較治療前明顯升高(P＜0.05)，IL-4較治療前明顯降低(P＜0.05)，IL-2/IL-4比值升高(P＜0.01)。結(jié)論CIN患者陰道灌洗液中IL-2表達(dá)下降，IL-4表達(dá)升高，IL-2/IL-4降低，且這些改變與CIN的嚴(yán)重程度相一致；鳳香洗液可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2的免疫平衡來阻斷疾病的進(jìn)展。

鳳香洗液；宮頸上皮內(nèi)瘤變；人乳頭瘤病毒；白介素-2；白介素-4

宮頸癌是一種感染性疾病，幾乎所有的宮頸癌都和高危型HPV(HR-HPV)有關(guān)[1]。宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)是宮頸癌前病變，和HPV感染也密切相關(guān)，因此，有效清除HPV感染、治療CIN甚至比治療宮頸癌本身更有現(xiàn)實意義。HR-HPV的清除與陰道微環(huán)境、宮頸免疫狀態(tài)密切有關(guān)。近年來關(guān)于Th亞群失衡的研究越來越受重視[2-3]，輔助性T細(xì)胞簡稱Th細(xì)胞，主要分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，可以分泌多種細(xì)胞因子。IL-2屬于Th1型細(xì)胞因子，IL-4屬于Th2型細(xì)胞因子。正常情況下兩類細(xì)胞因子處于平衡狀態(tài)。機(jī)體Th1/Th2平衡一旦失調(diào)，必然介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸、細(xì)菌、病毒等微生物的感染。多種中藥有抗病毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效，中醫(yī)藥防治HR-HPV感染可以阻斷CIN的惡性轉(zhuǎn)化[4]。從細(xì)胞因子水平分析中藥治療對陰道局部免疫的調(diào)節(jié)作用，探討中藥調(diào)動自身免疫清除病毒感染的作用機(jī)制。本研究通過測定HR-HPV感染的CIN患者陰道灌洗液中IL-2、IL-4的表達(dá)，了解CIN患者陰道局部免疫狀態(tài)，同時通過中藥鳳香洗液對CINⅠ組患者治療后陰道灌洗液中細(xì)胞因子的影響，從細(xì)胞因子水平分析中藥治療對陰道局部免疫的調(diào)節(jié)作用，探討中藥調(diào)節(jié)自身免疫清除病毒感染的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年7月至2015年2月于陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、西安西電集團(tuán)醫(yī)院門診就診，經(jīng)陰道鏡下宮頸活檢病理證實為CINⅠ、CINⅡ且伴有高危型HPV感染并且符合下述診斷及納入、排除標(biāo)準(zhǔn)的患者共60例(其中CINⅠ30例、CINⅡ30例)，對照組為同期健康體檢的婦女30例，婦科檢查及液基薄層細(xì)胞檢查(TCT)無異常。本研究通過陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均自愿參加本項目，并簽署知情同意書。

1.2 診斷及納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照謝幸[5]主編第八版《婦產(chǎn)科學(xué)》制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)：行宮頸TCT或?qū)m頸活組織病理學(xué)檢查即可確診。CINⅠ級為輕度異型，發(fā)生病變的細(xì)胞是上皮下的1/3層；CINⅡ級為中度異型，發(fā)生病變的細(xì)胞是上皮下的1/3～2/3。采用凱普13種高危型HPV核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測試劑盒檢測女性宮頸脫落細(xì)胞高危HPV-DNA定量，大于1.0×103即為陽性，可診斷高危HPV感染。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)年齡20～55歲，有正常性生活，常規(guī)宮頸癌前篩查經(jīng)組織病理學(xué)確診為CINⅠ～Ⅱ者并伴有HR-HPV感染；(2)就診前3 d未同房及陰道放藥；(3)未參加其他臨床研究；(4)了解知情同意書。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)懷孕中的婦女；(2)2周內(nèi)未接受宮頸的其他治療或患有其他生殖器感染性疾??；(3)免疫功能低下(患有各種免疫性疾病、惡性腫瘤、艾滋病或因免疫抑制劑導(dǎo)致免疫力低下等)；(4)合并嚴(yán)重的心臟病、肝、腎損害、血液系統(tǒng)相關(guān)疾病及精神病者；(5)依從性差，不能堅持治療，或不配合隨診者。

1.3 方法

1.3.1 藥物 鳳香洗液(由地龍、丁香、苦參、蛇床子等七味藥物組成)，由陜西中醫(yī)學(xué)院制藥廠提供。實驗用藥按要求定容，高壓滅菌備用。

1.3.2 標(biāo)本采集 囑所有研究對象在3 d內(nèi)不能同房，1周內(nèi)勿使用抗生素，在月經(jīng)干凈后第3日來院。取膀胱截石位，用窺器撐開陰道，暴露宮頸，用5 ml生理鹽水沖洗宮頸表面及陰道上1/3段，于后穹隆吸出灌洗液3～4 ml，剔除混有血液的標(biāo)本，避免血液中細(xì)胞因子干擾試驗結(jié)果。在室溫下，離心5 min，2000 r/min，取上清液，置于EP管中，在-80℃的冰箱保存，備用(標(biāo)本不能混有血液及反復(fù)凍融)。

1.3.3 用藥方法 CINⅠ組為用藥組，在月經(jīng)干凈第3天開始用藥。用窺器暴露宮頸，用藥前先如上法留取陰道灌洗液，用大棉球擦拭宮頸及陰道分泌物，將醮有鳳香洗液的棉球涂擦宮頸及陰道上段，有糜爛者置浸藥帶線棉球，囑患者6 h后自行取出。隔日用藥1次，7次為一個療程，連續(xù)使用3個療程，月經(jīng)期停藥。治療結(jié)束后第一次月經(jīng)干凈1周來院，留取陰道灌洗液行IL-2、IL-4檢測。CINⅡ組需要物理治療，故不納入用藥組。治療期間要求性生活使用避孕套，隨訪期間不能陰道用藥或沖洗，陰道內(nèi)不使用任何藥物。

1.3.4 主要試劑 IL-2、IL-4 ELISA試劑盒購自南京博爾塞生物科技有限公司。

1.3.5 檢測方法 IL-2、IL-4檢測采用雙抗體夾心ELISA法。分別取100 μl保存的上清液樣本，嚴(yán)格按照試劑盒的說明書要求操作，進(jìn)行實驗室檢測，每份標(biāo)本設(shè)復(fù)孔。于酶標(biāo)儀上以450 nm波長測樣本吸光度值，根據(jù)試劑盒提供的樣本制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算標(biāo)本中IL-2、IL-4濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，臨床資料統(tǒng)計采用描述性統(tǒng)計，IL-2、IL-4的表達(dá)強(qiáng)度及二者比值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間的均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK法，用藥前后的均數(shù)比較采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組陰道灌洗液中IL-2和IL-4水平表達(dá)情況 各組陰道灌洗液中IL-2和IL-4的水平見表1，各組均數(shù)方差均齊。CINⅠ組和CINⅡ組患者陰道灌洗液中IL-2表達(dá)水平顯著低于對照組(P＜0.01)，且CINⅡ組的降低程度較CINⅠ組更顯著(P＜0.01)，不同級別CIN病變中IL-2的表達(dá)強(qiáng)度隨宮頸病變程度的增加而降低。而CINⅠ組和CINⅡ組患者陰道灌洗液中IL-4表達(dá)水平均明顯高于對照組(P＜0.05)，且CINⅡ組的升高較CIN I組更明顯(P＜0.05)。不同級別CIN病變中IL-4的表達(dá)強(qiáng)度隨宮頸病變程度的增加而增加。

表1 各組陰道灌洗液中IL-2和IL-4水平表達(dá)情況(±s)

表1 各組陰道灌洗液中IL-2和IL-4水平表達(dá)情況(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與CIN I組比較，cP＜0.05，dP＜0.01。

對照組CINⅠ組CINⅡ組F值P值30 30 30 114.8±18.4 82.6±21.3b63.6±22.1bd47.08＜0.01 61.4±22.7 78.5±27.3a93.6±22.6bc13.192＜0.05

2.2 各組陰道灌洗液中IL-2/IL-4比值比較 根據(jù)測得的IL-2、IL-4水平計算其比值，CINⅠ組和CINⅡ組患者陰道灌洗液中IL-2/IL-4水平明顯低于對照組[(1.107±0.154)、(0.728±0.970)vs(1.248±0.310)，P＜0.05]，且CINⅡ組的降低程度較CINⅠ組更明顯[(1.107±0.154)vs(0.728±0.970)，P＜0.05]，說明IL-2/ IL-4的比值隨宮頸病變的加重而降低，與宮頸病變的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。

2.3 CINⅠ組用藥前后細(xì)胞因子IL-2、IL-4水平的表達(dá)比較 CINⅠ組在用藥后IL-2水平較治療前明顯升高，IL-4較治療前明顯降低，IL-2/IL-4比值顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 CINⅠ組用藥前后細(xì)胞因子的表達(dá)比較(n=30，±s)

表2 CINⅠ組用藥前后細(xì)胞因子的表達(dá)比較(n=30，±s)

用藥前用藥后t值P值82.6±21.3 99.6±26.4 2.664 0.010 78.5±27.3 65.9±19.7 2.050 0.044 1.107±0.154 1.308±0.158 4.989 0.000

3 討論

宮頸癌是威脅婦女健康的第二大惡性腫瘤。已有結(jié)論表明，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)是與宮頸浸潤癌的發(fā)生有直接關(guān)聯(lián)的一組癌前病變，而二者的發(fā)病均與高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染密切相關(guān)[6]。持續(xù)的高危型HPV(HR-HPV)感染是CIN和宮頸癌發(fā)病的首要因素[7]。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸HR-HPV持續(xù)感染可貫穿宮頸癌整個發(fā)生發(fā)展過程，在機(jī)體的全身免疫狀態(tài)發(fā)生改變之前，陰道及宮頸局部免疫狀態(tài)已經(jīng)發(fā)生改變[8]。HR-HPV持續(xù)感染可能直接影響陰道及宮頸免疫狀態(tài)。

T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在抗腫瘤免疫的過程中起重要作用。在特異性抗原刺激下Th細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成Th1、Th2兩個亞群。其中Th1群細(xì)胞以表達(dá)白細(xì)胞介素-2(IL-2)、γ干擾素(IFN-γ)為主，發(fā)揮其細(xì)胞毒作用，殺死靶細(xì)胞，參加細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th2群細(xì)胞[9]以表達(dá)IL-4、IL-6、IL-10為主，主要刺激B細(xì)胞增殖產(chǎn)生免疫球蛋白，參與體液免疫[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞在功能上相互拮抗，維持動態(tài)穩(wěn)定[3]，若Thl/Th2比值向Th2偏移，可出現(xiàn)機(jī)體免疫狀態(tài)的紊亂，隨后引起感染性疾病或者腫瘤，也就是近年來提出的“Thl/Th2漂移”理論。本研究以CIN患者為研究對象，正常人群作為對照，以陰道免疫微環(huán)境為切入點，通過檢測Thl、Th2代表性的細(xì)胞因子IL-2、IL-4，研究在高危HPV感染的CIN人群中是否存在“Thl/Th2漂移”現(xiàn)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CIN患者的陰道灌洗液中IL-2的表達(dá)強(qiáng)度隨宮頸病變程度的增加而降低，而IL-4的表達(dá)強(qiáng)度隨宮頸病變程度的增加而增加，IL-2/IL-4比值隨宮頸病變的加重而降低。可見，隨宮頸病變程度的加重，Th1/Th2比值呈下降趨勢，Th1向Th2的漂移越來越明顯。

目前與宮頸癌防治有關(guān)的研究在西醫(yī)學(xué)方面主要以抗腫瘤、抗病毒為重點。近年來開始使用HPV疫苗，但因其價格昂貴，尚未普及，且不能涵蓋所有的HPV亞型。一些被公認(rèn)的抗病毒藥物療效在臨床上治療效果并不確定，而中醫(yī)藥治療在HPV感染方面近期取得了一定的成效，具有相當(dāng)大的研發(fā)潛力。中藥“鳳香洗液”是我院賀豐杰教授經(jīng)過長期臨床摸索、實驗觀察，結(jié)合祖國醫(yī)學(xué)理論與現(xiàn)代中藥藥理研究，研發(fā)的中藥制劑。它由地龍、丁香、苦參、蛇床子等7味中藥組成。已經(jīng)臨床驗證其具有高效殺蟲、抗菌、抗病毒作用。研究表明，地龍、丁香可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，蛇床子、苦參[10]能增加網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的吞噬功能，從而調(diào)節(jié)免疫，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、殺蟲等功效。地龍是我國傳統(tǒng)中藥材，能夠治療多種疾病，近年來開始應(yīng)用于治療免疫疾病和腫瘤。已有研究表明地龍體內(nèi)可提取多種具有生物活性的物質(zhì)[11-12]。地龍?zhí)崛∫褐泻械佚埶?、地龍解熱素、維生素B族復(fù)合體等成分，可以作為免疫調(diào)節(jié)劑，用來研制抗癌新藥。研究發(fā)現(xiàn)這些成分可以增加胸腺、脾的重量以及細(xì)胞數(shù)目，有效消除放療引起的T細(xì)胞免疫功能低下和輻射引起的體液免疫功能低下?？梢?，幾味中藥有一個共同的特點，即能增強(qiáng)免疫功能。

女性生殖道HR-HPV持續(xù)感染與陰道局部免疫功能低下有關(guān)。本研究中在用鳳香洗液治療后CINⅠ組中IL-2水平增高，而IL-4水平降低，出現(xiàn)IL-2/ IL-4比值的逆轉(zhuǎn)，表明經(jīng)過鳳香洗液治療，逆轉(zhuǎn)了TH2漂移的趨勢，促進(jìn)Th1/Th2恢復(fù)平衡狀態(tài)，改善了陰道的免疫狀態(tài)，為宮頸病變向正常轉(zhuǎn)化提供了有利的微環(huán)境。說明中藥“鳳香洗液”對宮頸局部微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)起到重要的作用，有望通過改善局部免疫狀態(tài)達(dá)到清除HPV的目的，從病因?qū)W上阻斷宮頸癌的發(fā)生，實現(xiàn)宮頸癌的一級預(yù)防。

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Effects of traditional Chinese medicine“Fengxiang Lotion”on local cervical IL-2 and IL-4 in patients of cervical intraepithelial neoplasia with HPV infection.

LI Xiao-ning1,HE Feng-jie1,JI Zhe2.1.Department of Gynecology,the Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712021,Shaanxi,CHINA;2. Department of Gynecology,Xi'an XD Group Hospital,Xi'an 710077,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo observe the effects of traditional Chinese medical compound“Fengxiang Lotion”on the local vaginal immune state for patients of cervical intraepithelial neoplasia(CIN)with human papillomavirus (HPV)infection.MethodsSixty patients with high risk HPV infection diagnosed with cervical biopsy using colposcopy in the Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine and Xi'an XD Group Hospital from July2013 to February 2015 were selected in the study,which were divided into CINⅠand CINⅡgroup(n=30 each). Thirty healthy women coming for medical examination during the same period served as the control group.CINⅠgroup received Fengxiang Lotion for treatment,while the other two groups not.The levels of interleukin(IL)-2 and IL-4 in cervical-vaginal lavage solution,which were synthesized by type 1 and type 2 helper T cells respectively,were tested by ELISA.Results(1)IL-2 levels of CINⅠgroup and CINⅡgroup were significantly lower than that of the control group(P＜0.01),while IL-4 levels of CINⅠgroup and CINⅡgroup were significantly higher (P＜0.05).The ratios of IL-2 to IL-4 in CINⅠgroup and CINⅡgroup were significantly lower than that of the control group(P＜0.05).What's more,all these changes was more significant in CINⅡgroup than CINⅠgroup(P＜0.05).(2)In CINⅠgroup,the IL-2 level increased significantly after medication(P＜0.05),while IL-4 decreased significantly(P＜0.05),with the ratio of IL-2 to IL-4 increased significantly(P＜0.01).ConclusionThe IL-2 levels and IL-2/IL-4 ratio in CIN patients with HPV decreased,while IL-4 increased.These changes were consistent with the severity of CIN.“Fengxiang Lotion”may block the progression of CIN through regulating the balance of Th1 and Th2.

Fengxiang Lotion;Cervical intraepithelial neoplasia(CIN);Human papillomavirus(HPV);Interleukin-2(IL-2);Interleukin-4(IL-4)

R711.74

A

1003—6350（2015）24—3604—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.24.1303

2015-07-16)

陜西省教育廳自然科學(xué)專項（編號：2013JK0799）

賀豐杰。E-mail：hefengjiet@tom.com