黃維真 綜述,潘新年 審校

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院/婦產(chǎn)醫(yī)院/兒童醫(yī)院，南寧 530021)

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·綜 述·

腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶的研究進(jìn)展

黃維真 綜述,潘新年 審校

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院/婦產(chǎn)醫(yī)院/兒童醫(yī)院，南寧 530021)

碳青霉烯酶； 腸桿菌科細(xì)菌； 檢測方法

碳青霉烯類抗菌藥物是抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、殺菌作用快的β-內(nèi)酰胺類藥物，其良好的細(xì)胞通透性、高度的酶穩(wěn)定性及較低的毒性等特點(diǎn)已成為目前臨床治療嚴(yán)重細(xì)菌感染最主要的抗菌藥物之一，但是隨著碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的腸桿菌科細(xì)菌的出現(xiàn)及不斷的增多，該類藥物的臨床應(yīng)用受到了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶。因此，快速、準(zhǔn)確地檢測產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌，對于預(yù)防和控制產(chǎn)酶菌株的傳播具有重要意義?，F(xiàn)就實(shí)驗(yàn)室檢測腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶的研究進(jìn)展作一綜述。

1 產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌的篩查(表型篩查試驗(yàn))

準(zhǔn)確檢測腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性是篩選產(chǎn)酶菌株的關(guān)鍵，試驗(yàn)方法及底物選擇影響產(chǎn)酶菌株的篩選。Anderson等[1]以blaKPC基因作為金標(biāo)準(zhǔn)，采用亞胺培南、美羅培南、厄他培南對微量肉湯稀釋法、E-test法、平板稀釋法、Microscan Autoscan、Vitek-2等方法作比較，微量肉湯稀釋法對3種抗菌藥物敏感性大于90%，能較好檢測出細(xì)菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性。不同實(shí)驗(yàn)底物對產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌篩查的敏感性、特異性各不相同，Landman等[2]研究報(bào)道，以厄他培南作底物的肉湯稀釋法、E-test法、平板稀釋法、自動(dòng)化儀器法敏感性大于90%,為最高，但特異性低于亞胺培南和美羅培南，提示厄他培南應(yīng)該作為藥物敏感性試驗(yàn)檢測最佳底物。近期有研究顯示，菌株對厄他培南的敏感性下降是產(chǎn) KPC酶的敏感標(biāo)志[3]。2010 年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)對腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯類藥物折點(diǎn)進(jìn)行了修訂，耐藥范圍能更好地覆蓋最小抑菌濃度(MIC) 值較低的產(chǎn)酶菌株。然而，篩查范圍過寬會(huì)造成高產(chǎn)AmpC 或產(chǎn) CTX-M 型 ESBLs 合并外膜通道蛋白缺失菌株非特異的假陽性[4]。由于碳青霉烯酶耐藥異質(zhì)性，至今尚未有對所有產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌表型檢測的公認(rèn)和CLSI等國際權(quán)威機(jī)構(gòu)推薦的方法。因此，對碳青霉烯酶的篩查需要敏感性更高的檢測方法。

2 表型確認(rèn)試驗(yàn)

2.1 改良Hodge(MTH) MTH是CLSI推薦的用于檢測碳青霉烯酶表型的確認(rèn)試驗(yàn)。CLSI根據(jù)美國大量腸桿菌科分離菌株進(jìn)行試驗(yàn)，MTH檢測這些分離菌株中的KPC，敏感度和特異度均大于90%。MTH在篩選產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌時(shí)敏感性低、特異性差、周期長，對低水平金屬β-內(nèi)酰胺酶的敏感性和特異性有待評(píng)估。MTH不能區(qū)分碳青霉烯酶類型，其他耐藥機(jī)制(如CTX-M、AmpC)存在時(shí)也可能出現(xiàn)25%的假陽性。Fernando 等[5]設(shè)計(jì)在MHT加入苯硼酸和苯唑西林進(jìn)行改良MTH，改良后MHT對A類碳青霉烯酶檢測的靈敏度和特異性更高(>90%,100%),通過不同圖形可將產(chǎn)KPC、GES、SME、IMI、NMC A類碳青霉烯酶與ESBLs、AmpC、MBLs、非A類碳青霉烯酶區(qū)分開來。

2.2 紙片增效試驗(yàn) 碳青霉烯類抗菌藥物加上酶抑制劑紙片增效試驗(yàn)常作為檢測金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)的方法，根據(jù)乙二胺四乙酸(EDTA)抑制MBL特性的E-test試條作為檢測MBL建議的方法，但是由于E-test試紙條成本較高，其他β-內(nèi)酰胺酶耐藥機(jī)制和膜孔蛋白缺失或高度表達(dá)影響MIC的結(jié)果[6]。一種包含美羅培南聯(lián)合抑制劑EDTA、吡啶二羧酸、氨基苯硼酸、氯唑西林碳青霉烯酶檢測的試驗(yàn)，可檢測出KPC、VIM、IPM、OXA和碳青霉烯類耐藥腸桿菌伴膜孔蛋白缺失ESBL、AmpC[7]。利用苯硼酸對KPC的高敏感度，合并AmpC和膜孔蛋白缺失也可檢出，與KPC不同，氯唑西林對AmpC和膜孔蛋白有協(xié)調(diào)作用。EDTA、吡啶二羧酸擁有較高的靈敏度檢測產(chǎn)金屬酶肺炎克雷伯菌，EDTA特異性較差，少量ESBL、KPC、OX-48也可出現(xiàn)陽性，但吡啶二羧酸特異性較強(qiáng)，只有MBL出現(xiàn)陽性，ESBL、KPC、OX-48都為陰性。Emilie 等[8]報(bào)道拉氧頭孢+EDTA協(xié)同試驗(yàn)檢測MBL，拉氧頭孢高水平水解質(zhì)粒介導(dǎo)的金屬β-內(nèi)酰胺酶，但對絲氨酸碳青霉烯酶水解能力偏弱，拉氧頭孢對所有MBL(包括IPM、VIM等)都耐藥(<23 mm),EDTA能增強(qiáng)拉氧頭孢抑菌圈直徑(≥10 mm)。拉氧頭孢敏感試驗(yàn)作為常規(guī)抗菌試驗(yàn)，用于敏感篩選MBL甚至低產(chǎn)MBL的方法。拉氧頭孢+EDTA協(xié)同試驗(yàn)用于不同MBL及膜孔蛋白改變的確認(rèn)，方法簡單、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果易于觀察，適合于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢驗(yàn)。

3 培養(yǎng)法

通過選擇性的在顯色培養(yǎng)基中加入碳青霉烯類抗菌藥物篩選產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌。Panagea等[9]比較CHROMagar KPC與加亞胺培南麥康凱培養(yǎng)基篩選產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌的檢測結(jié)果,其陽性和陰性預(yù)測值分別為CHROMagar 100.0%和98.8%，亞胺培南麥康凱培養(yǎng)基94.7%和88.6%。盡管bla(KPC)和bla(VIM)在CHROMagar上無法從顏色或菌落形態(tài)進(jìn)行區(qū)分，但CHROMagar KPC是一個(gè)有效的篩選培養(yǎng)基，適用于糞便中篩選各種產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科。一種包含厄他培南、氯唑西林、硫酸鋅的培養(yǎng)基(SUPERCARBA)能篩選出(除OXA-163外)OXA-48、NDM、VIM、IMP 和KPC腸桿菌科細(xì)菌，(1～3)×10 cfu/100 mg的濃度就能檢出，敏感性比ChromID ESBL (bioMérieux)和CHROMagar KPC (CHROMagar)都高[10]。SUPERCARBA培養(yǎng)基能有效提高檢測產(chǎn)碳青霉烯酶(多數(shù)常見類型)腸桿菌的能力，更廣范圍檢測產(chǎn)碳青霉烯酶任何類型。ID Carba是一種新顯色培養(yǎng)基，在檢測NDM-1比Colorex KPC更敏感,有可能作為篩查NDM-1的篩選培養(yǎng)基[11]。

4 生物化學(xué)方法

4.1 Carba NP test[12]Patrice Nordmann研發(fā)了Carba NP test，采用細(xì)菌細(xì)胞裂解后的酶粗提物與亞胺培南進(jìn)行反應(yīng)，碳青霉烯酶能水解碳青酶烯類抗菌藥物，使其開環(huán)伴H+產(chǎn)生，一定濃度H+可使檢測液中的酚紅指示劑變色，根據(jù)顏色變化進(jìn)行判斷，推測菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶，根據(jù)不同酶抑制劑進(jìn)一步確定產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的組別。通過生化反應(yīng)能較好區(qū)分碳青霉烯類耐藥菌株的耐藥機(jī)制。Carba NP對大多數(shù)產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌在15～30 min可檢出，Carba NP 100% 的OXA-48、KPC、IMP能被檢出(無論非選擇培養(yǎng)基還是選擇培養(yǎng)基)，VIM、NDM只能從補(bǔ)充鋅Mueller-Hinton瓊脂被檢出。Dortet等[13]研究表明鋅離子濃度是Carba NP檢測VIM、NDM-1的關(guān)鍵。Carba NP 還可用于直接檢測血培養(yǎng)細(xì)菌、培養(yǎng)基上生長菌落及臨床標(biāo)本，但陽性、陰性預(yù)測值有待評(píng)估。該試驗(yàn)與分子生物學(xué)技術(shù)比較，敏感性、特異性均為100%，2 h可獲得結(jié)果，經(jīng)濟(jì)實(shí)用且不需要其他技術(shù)，可在醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室日常實(shí)施。

4.2 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)方法[14]將細(xì)菌菌液加入到含美羅培南十二烷基硫酸鈉Tris-Hcl-Nacl緩沖液中，35 ℃孵育2 h，1 μL上清液與1 μL二甲基苯甲酸混合后進(jìn)行MALDI-TOFMS檢測，產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌由于可以水解美羅培南出現(xiàn)358.5、380.5 m/z質(zhì)譜峰，不出現(xiàn)384.5、406.5 M/Z質(zhì)譜峰，非產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌則相反，通過質(zhì)譜峰的變化可以鑒定產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌。MALDI-TOFMS法與PCR、測序法、分光光譜測量法結(jié)果高度一致，無假陽性、假陰性結(jié)果。該法可快速、準(zhǔn)確直接檢測酶活性，其不僅可以作為鑒定依據(jù)還可以用于耐藥機(jī)制分析，但是要注意標(biāo)本晾干后立即用質(zhì)譜儀測定，如耽擱1 h后會(huì)引起美羅培南降解而變異。

4.3 二氧化硅磁珠法[15]用二氧化硅磁珠快速裂解產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌，檢測提取物對亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶水解活性，根據(jù)酶底物特異性和EDTA、克拉維酸抑制不同碳青霉烯酶的特點(diǎn)，快速區(qū)分絲氨酸碳青霉烯酶和金屬碳青霉烯酶。

4.4 分光光度計(jì)法 分光光度計(jì)檢測碳青霉烯酶的水解作用是檢測可疑菌株碳青霉烯酶產(chǎn)生的參考方法。分別檢測細(xì)菌粗提物或部分純化酶加抑制劑和不加抑制劑，對碳青霉烯類藥物水解前后的吸光度，檢測酶的活性。這種方法能夠獲取酶型，但必須在參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

5 免疫層析法[16]

根據(jù)金屬酶抗原表位的單克隆抗體建立免疫層析法可以直接檢測碳青霉烯類不敏感的IPM β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌和非發(fā)酵菌，免疫層析法直接檢測 IMP-MBLs(包括IMP-1、-2、-6、-7、-10、-11、-19、-20、-22、-40、-41、-42新型),IMP-MBLs通過與雙紙片增效試驗(yàn)、MBL E-test、MTH比較，PCR證實(shí)，敏感性、特異性均為100%，有關(guān)試驗(yàn)結(jié)果表明,對于 IMP-MBLs免疫層析法有可能替代PCR。

6 分子生物學(xué)方法

6.1 PCR法 包括普通PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)PCR、分子信標(biāo)多重實(shí)時(shí)PCR，PCR技術(shù)采用基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及基因測序，可以檢測細(xì)菌是否具有碳青霉烯酶基因，多重PCR技術(shù)通過在1個(gè)反應(yīng)體系中加入多對特異引物可以在1次反應(yīng)中檢測多種目的基因。van der Zee等[17]采用多重實(shí)時(shí)PCR準(zhǔn)確、快速地檢測Carbapenemases bla OXA-48、blaVIM、blaIMP、blaNDM、blaKPC,而且適用于篩選肉湯培養(yǎng)或直腸拭子和臨床標(biāo)本。實(shí)時(shí)熒光定量PCR用熒光定量探針對所有blaKPC進(jìn)行擴(kuò)增，陽性擴(kuò)增產(chǎn)物被BstNⅠ和RsaⅠ進(jìn)行酶切消化分析以區(qū)分blaKPC1-3型基因。分子信標(biāo)多重實(shí)時(shí)PCR根據(jù)熒光強(qiáng)度和熒光類型能檢測出blaKPC-2～blaKPC-11,有學(xué)者報(bào)道用分子信標(biāo)多重實(shí)時(shí)PCR可檢測NDM-1基因。與常規(guī)PCR相比較，分子信標(biāo)多重實(shí)時(shí)PCR可以進(jìn)行閉管操作，有效消除核酸交叉污染，具有實(shí)時(shí)、定量、高靈敏度、高特異性特點(diǎn)。在臨床應(yīng)用中PCR 法是檢測碳青霉烯酶基因的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于需要特殊儀器設(shè)備，費(fèi)用昂貴，不適合臨床實(shí)驗(yàn)室開展，另外其也無法檢測細(xì)菌大量耐藥的機(jī)制和碳青霉烯類耐藥的其他機(jī)制。

6.2 核酸微陣列法[18]PCR是最廣泛使用的分子技術(shù)，然而這些方法仍然耗時(shí)。核酸微陣列法從提取DNA到結(jié)果報(bào)告僅需7～8 h。Check-MDR CT102微陣列除了檢測KPC、OXA-48、VIM、IMP、NDM-1碳青霉烯酶基因，還可檢測TEM、SHV、CTX-M ESBLs，blaVIM、blaIMP、blaNDM、blaOXA-48基因，其特異性和敏感性都為100.0%,而blaKPC基因分別為100.0%和85.0%。blaVIM、blaIMP、blaNDM、blaOXA-48基因,陽性和陰性預(yù)測值都是100.0%，blaKPC基因的陽性和陰性預(yù)測值分別為100.0%和98.0%。核酸微陣列可區(qū)分同一分離株中產(chǎn)碳青霉烯酶基因及ESBLs、AmpC、膜孔蛋白缺失，但對于不動(dòng)桿菌(OXA-23、OXA-24、OXA-58)可能會(huì)漏檢，無法檢測少見的PER、GES、VEB、BEL-1、ESBLs，無法區(qū)分各種酶亞型。

6.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) Notomi首先提出了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其利用一種具有鏈置換反應(yīng)DNA聚合酶和2對特殊引物，對靶序列上的6個(gè)特異序列進(jìn)行特異擴(kuò)增,在65 ℃的等溫條件下反應(yīng)1 h即可將靶序列DNA擴(kuò)增109～1010倍,產(chǎn)生肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉淀。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增與PCR比較，檢測bla(NDM-1)和bla(KPC)具有更大的敏感性和特異性且快速，NDM-1陽性參考菌株基因組每管1 pgDNA檢出[19]。345份臨床樣本的檢測結(jié)果顯示,與PCR檢測結(jié)果100%的一致,其中3個(gè)受污染的標(biāo)本被正確檢出,PCR卻不能，但其高敏感性可能造成假陽性導(dǎo)致應(yīng)用受到一定的限制[20]。

7 結(jié) 語

產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因。碳青霉烯酶的檢測方法主要有耐藥菌篩選、表型確認(rèn)、基因水平分析等，效能各有利弊，而快捷、方便、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測方法有待進(jìn)一步研究。臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)流行病學(xué)資料制定統(tǒng)一的適合該地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室檢測標(biāo)準(zhǔn)，將碳青霉烯酶檢測作為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)項(xiàng)目，可最大限度地發(fā)現(xiàn)耐藥菌株，為臨床提供快速、準(zhǔn)確的信息，針對性地進(jìn)行抗菌治療和控制產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌的傳播，防止該類病原菌的擴(kuò)散，有效控制醫(yī)院感染的發(fā)生。

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廣西醫(yī)藥衛(wèi)生自籌經(jīng)費(fèi)計(jì)劃課題(Z2014152)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.060

A

1672-9455(2015)12-1798-03

2014-12-22

2015-02-15)