劉珊珊，劉 鵬，周玲妹，柳志強(qiáng)，鄭裕國

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，浙江 杭州 310014）

脂肪酶是最早應(yīng)用于非水相生物催化的酶之一。近年來，絕大部分商品化脂肪酶如Novozym 435、Lipozym等都來源于微生物。脂肪酶能夠催化水解、酯化、轉(zhuǎn)酯化、多肽合成等反應(yīng)，它的催化活性高、底物譜廣泛，無論在酶學(xué)理論研究和實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，都受到廣泛關(guān)注。隨著非水酶學(xué)的發(fā)展，進(jìn)一步推動了脂肪酶在各領(lǐng)域中的應(yīng)用。有機(jī)溶劑是一種主要的非水介質(zhì)，廣泛應(yīng)用于生物催化反應(yīng)。有機(jī)相中脂肪酶催化的研究主要開始于20世紀(jì)80年代，美國麻省理工學(xué)院Zaks和Klibanov教授為首的研究小組對有機(jī)相介質(zhì)中脂肪酶的催化行為及熱穩(wěn)定性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。目前，有機(jī)溶劑中脂肪酶的催化反應(yīng)已廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、新能源等領(lǐng)域。但游離的脂肪酶在有機(jī)相中的應(yīng)用仍受到限制，在有機(jī)相中脂肪酶的活力和穩(wěn)定性一般會下降，游離酶容易發(fā)生聚集，單個(gè)酶分子不能與底物作用，從而影響反應(yīng)速率，限制了其在工業(yè)化領(lǐng)域的應(yīng)用。為了提高脂肪酶在有機(jī)相中的催化性能，固定化是一種簡單有效的手段，可有效避免游離酶的自聚和分解。脂肪酶還存在界面激活效應(yīng)，疏水性載體或表面活性劑可以改變脂肪酶分子的構(gòu)象，相比游離酶，固定化脂肪酶的催化活力和穩(wěn)定性會有很大的提高。本文對脂肪酶在有機(jī)相體系中的催化反應(yīng)、固定化方法及其應(yīng)用做了簡要概述。

1 脂肪酶在有機(jī)相中的催化反應(yīng)

酶作為主要的生物催化劑，具有特定功能的酶的開發(fā)是促進(jìn)現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)。有機(jī)相中脂肪酶催化性能的發(fā)現(xiàn)打破了生物催化反應(yīng)必須在水相中進(jìn)行的傳統(tǒng)理念，開拓了生物酶廣闊的應(yīng)用前景。

相對于傳統(tǒng)的水相催化，將有機(jī)溶劑體系應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)有著絕對的優(yōu)勢。酶在有機(jī)相中可以催化傳統(tǒng)化學(xué)難以催化的反應(yīng)，可增大疏水性底物的溶解度，提高有水生成反應(yīng)的產(chǎn)率，抑制有水參與的副反應(yīng)發(fā)生，底物的專一性和選擇性包括區(qū)域選擇性和對映體選擇性均大大提高，同時(shí)有機(jī)相催化對酶的固定化要求不高，后續(xù)產(chǎn)物分離過程容易。因此人們逐漸重視非水相酶催化被并進(jìn)行了大量且卓有成效的研究，目前已經(jīng)報(bào)道的能在非水相中進(jìn)行催化反應(yīng)的酶包括多種：如蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶、過氧化氫酶、醛縮酶、醇脫氫酶等，其中研究最為深入和廣泛的是脂肪酶。脂肪酶具有多種催化能力，能夠催化水解、酯化、酯交換、醇解和酸解等一系列的反應(yīng)，且具有催化效率高、催化穩(wěn)定性好、底物專一性高以及底物譜廣等優(yōu)點(diǎn)。不同來源的脂肪酶往往具有不同的底物特異性、催化活力和催化特性，但其立體結(jié)構(gòu)都具有一個(gè)α/β折疊結(jié)構(gòu)、催化結(jié)合位點(diǎn)和氧負(fù)離子疏水通道，不同的脂肪酶二級結(jié)構(gòu)在經(jīng)典的α/β水解酶結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上加以變化，活性中心Ser殘基通常被一個(gè)α螺旋“蓋子”覆蓋，“蓋子”的存在導(dǎo)致底物很難靠近催化活性中心，造成脂肪酶催化效率的下降。覆蓋脂肪酶活性中心的“蓋子”其外表面相對親水，面向活性位點(diǎn)的內(nèi)表面則相對疏水，當(dāng)酶處于閉合狀態(tài)時(shí)這個(gè)蓋子會把活性位點(diǎn)覆蓋，當(dāng)處于油水界面時(shí)，這個(gè)蓋子會被移開，酶的活性被激發(fā)。在有機(jī)相體系中，脂肪酶的催化結(jié)合位點(diǎn)保持著與水相體系相似的完整三維立體結(jié)構(gòu)，由于有機(jī)相體系中存在少量的水，形成油水兩相界面，脂肪酶發(fā)生界面激活作用，可以催化在水相中不能進(jìn)行的酯化和轉(zhuǎn)酯化等反應(yīng)。

2 脂肪酶有機(jī)相催化的影響因素

有機(jī)相介質(zhì)中脂肪酶催化反應(yīng)的研究已取得了突破性的進(jìn)展，脂肪酶在一些特定的有機(jī)相體系中能夠保持較高的催化活性和穩(wěn)定性，但是對有機(jī)溶劑中酶促反應(yīng)機(jī)理的認(rèn)識還不夠透徹，仍然局限于非水環(huán)境中微環(huán)境對酶的活性及穩(wěn)定性的影響。根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有機(jī)相中脂肪酶催化活性和穩(wěn)定性的維持除了受酶本身的影響外，體系中含水量、有機(jī)溶劑的性質(zhì)都是重要的影響因素[1]。

2.1 水含量對脂肪酶有機(jī)相催化的影響

水是決定有機(jī)相中生物催化反應(yīng)效率的一個(gè)重要因素，脂肪酶的生物催化活力、穩(wěn)定性及特異性與反應(yīng)體系中的含水量密切相關(guān)。有機(jī)相中的微量水主要以兩種形式存在，一類是與酶分子緊密結(jié)合的結(jié)合水，另一類是溶于有機(jī)相的游離水。與酶分子緊密結(jié)合的結(jié)合水使酶分子的周圍形成一層水化層，對酶的催化活性至關(guān)重要；與酶蛋白緊密結(jié)合的這一單層水分子稱為“必需水”，通過氫鍵、范德華力等非共價(jià)鍵間的相互作用來維持酶的活性構(gòu)象，影響酶的催化活性。從微觀上看有機(jī)溶劑中酶的生物催化反應(yīng)并不是在絕對沒有水存在的情況下發(fā)生的，而是一種微水相反應(yīng)。通過對酶必需水的調(diào)控，可以調(diào)節(jié)有機(jī)相酶催化反應(yīng)的催化活性。同時(shí)，水的存在也可能導(dǎo)致酶的“熱失活”，降低酶催化的穩(wěn)定性，在有水生成的可逆反應(yīng)中如酯化反應(yīng)，水也會對熱力學(xué)平衡產(chǎn)生影響，對產(chǎn)物的生成造成不利影響。因此水是酶在有機(jī)相中進(jìn)行催化反應(yīng)所必需的，只有在最適含水量的條件下，酶才能表現(xiàn)出最高的活力。Zaks等[2]的研究表明有機(jī)相中含有微量的水對酶活性的維持至關(guān)重要。Herbst等[3]研究了在正己烷和四氫呋喃混合有機(jī)相體系中，通過向體系中加水的方式考察水含量對Candida rugosa脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的影響，水的加入增加了酶的柔性，提高了底物轉(zhuǎn)化率，繼續(xù)增加水含量，酶發(fā)生聚集，導(dǎo)致酶活力降低。

2.2 有機(jī)溶劑的性質(zhì)對脂肪酶有機(jī)相催化的影響

有機(jī)溶劑能直接或者間接地影響酶的活力與穩(wěn)定性，通常用log P值表征有機(jī)溶劑的疏水性與酶的催化反應(yīng)活性，log P值指某物質(zhì)在正辛醇（油）和水中的分配系數(shù)比值的對數(shù)值。以有機(jī)溶劑為非水相體系，根據(jù)有機(jī)溶劑的log P值，可選擇合適的非水相體系，log P值越小溶劑的疏水性小，能夠奪取脂肪酶分子表面的必需水，從而使脂肪酶活力降低甚至導(dǎo)致酶失活；log P值越大則溶劑疏水性越大，疏水性大的有機(jī)溶劑對脂肪酶分子必需水奪取較少，從而保持了脂肪酶分子的完整性，脂肪酶往往更加穩(wěn)定，但不利于底物和產(chǎn)物在水化層的擴(kuò)散，影響底物與脂肪酶活性中心的接觸，使生物催化反應(yīng)受到抑制。此外，有機(jī)溶劑還可能與脂肪酶分子直接發(fā)生作用，有機(jī)溶劑分子通過與脂肪酶分子間的相互作用使脂肪酶分子的氫鍵或疏水鍵等發(fā)生改變從而改變脂肪酶分子的構(gòu)象，影響脂肪酶的催化活力。一般情況，脂肪酶催化的酯化與轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)所選擇的有機(jī)溶劑的log P值為2～5，在這個(gè)范圍內(nèi)脂肪酶催化的反應(yīng)容易獲得最佳反應(yīng)條件，酶與底物間的作用更加靈活。Chen等[4]研究了不同疏水性的有機(jī)溶劑對Candida cylindracea脂肪酶催化合成丁酸乙酯的影響，結(jié)果表明游離和固定化的脂肪酶分別在正戊烷（log P=3.2）和正己烷（log P=3.5）體系中獲得最高的產(chǎn)率。Yin等[5]采用固定化Candida sp.脂肪酶催化合成維生素A酯類衍生物，考察6種不同疏水性的有機(jī)溶劑對維生素A醋酸酯轉(zhuǎn)酯化合成維生素A棕櫚酸酯的影響，在正己烷 （log P=3.5）、異辛烷（log P=4.5）和石油醚（log P=3.0）三種有機(jī)相體系中可以獲得較高的產(chǎn)率，在叔戊醇（log P=1.15）體系中維生素A棕櫚酸酯的產(chǎn)率僅為8.4%。

3 脂肪酶的固定化

3.1 脂肪酶固定化的概述

脂肪酶作為一種特殊的生物催化劑，已被廣泛應(yīng)用于有機(jī)介質(zhì)的生物催化反應(yīng)，其固定化技術(shù)是得以工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵因素。脂肪酶的固定化就是通過物理或化學(xué)方法將脂肪酶與載體相結(jié)合，使其不溶于含有底物的相，從而使脂肪酶被集中或限制在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)。固定化脂肪酶不僅具有一般固定化酶共有的優(yōu)點(diǎn)，可有效避免游離酶的自聚和分解、穩(wěn)定性高、易回收和可重復(fù)利用等，同時(shí)脂肪酶的突出特點(diǎn)是具有界面激活作用，在油水界面上催化活力增強(qiáng)，疏水性載體或表面活性劑可使酶分子構(gòu)象發(fā)生改變，覆蓋脂肪酶催化活性位點(diǎn)的“蓋子”被打開，脂肪酶的活性可顯著提高。游離的脂肪酶遇高溫、高鹽、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等穩(wěn)定性差、易失活，在脂肪酶的固定化過程中應(yīng)盡可能避免會破壞酶蛋白高級結(jié)構(gòu)的因素，且脂肪酶的固定化成本不宜過高，以利于工業(yè)化應(yīng)用。目前，脂肪酶固定化方法的改進(jìn)主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是固定化載體的設(shè)計(jì)、制備和選用；二是載體固定化脂肪酶所用的方法技術(shù)。

3.2 脂肪酶的固定化方法

脂肪酶的固定化方法包括吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價(jià)結(jié)合法。采用物理法進(jìn)行脂肪酶的固定化的優(yōu)勢在于酶不參加化學(xué)反應(yīng)，其整體結(jié)構(gòu)保持不變，酶的催化活性被保留，但是由于存在一定的空間位阻，對一些反應(yīng)不適用；化學(xué)法使用交聯(lián)劑通過酶表面的基團(tuán)將酶交聯(lián)起來，或者通過化學(xué)鍵將酶連接到天然的或者合成的高分子載體上，而形成相對分子量大、不溶性的固定化酶。由于脂肪酶具有特定的結(jié)構(gòu)特征，在利用吸附法和包埋法制備固定化脂肪酶時(shí)通常使用表面具有一定疏水性的載體，由此制備的固定化酶活力會有較大的提高。

3.2.1 吸附法固定化脂肪酶

吸附法是利用氫鍵、范德華力、疏水作用或離子鍵等相互作用力將酶直接吸附到水不溶性載體表面上，吸附條件溫和，酶蛋白的活性中心不易受到破壞且酶的高級結(jié)構(gòu)沒有明顯變化，酶活力損失較小，但是酶與載體間的作用力較弱，酶容易從載體表面脫落，重復(fù)利用率低。目前固定化脂肪酶多用于非水相催化反應(yīng)，脂肪酶在有機(jī)溶劑中不同于在水中，脂肪酶與載體間的作用力不需要很強(qiáng)，因此吸附法最常用于非水相反應(yīng)體系固定化脂肪酶的制備。Kharrat等[6]用硅膠為載體物理吸附Rhizopus oryzae脂肪酶（ROL），與游離酶相比，所得的固定化酶熱穩(wěn)定性、非極性有機(jī)溶劑耐受性、儲存穩(wěn)定性及最適pH范圍都有明顯的提高，重復(fù)使用12個(gè)批次后固定化酶的催化活力沒有明顯降低。Hernandez等[7]采用Diaion HP20LX和MCI GEL CHP20P兩種商品化多孔苯乙烯-二乙烯基苯微球?yàn)檩d體對南極假絲酵母脂肪酶B進(jìn)行簡單有效的固定化，比較了不同載體對脂肪酶固定化的影響，并同商品化脂肪酶Novozym 435相比較，結(jié)果表明，以MCI GEL CHP20P為載體，酶蛋白吸附量是decaoctyl Sepabeads載體的兩倍，CALB-MCI GEL CHP20P固定化酶顯示了優(yōu)異的應(yīng)用性能。

3.2.2 包埋法固定化脂肪酶

包埋法是將酶包埋在一定的微小空間內(nèi)，以疏水性有機(jī)硅烷為前體采用溶膠凝膠法包埋脂肪酶是應(yīng)用較廣泛的一種固定化方法，此外也有將脂肪酶包裹在硝酸纖維素等半透性高分子膜中的報(bào)道。包埋法操作簡單，對酶活影響較小，制備的固定化酶強(qiáng)度較高，使用相同的固定化材料溶膠凝膠包埋法制備的固定化酶較吸附法具有更好的操作穩(wěn)定性。1996年，Reetz等[8]首次采用疏水性的甲基三甲氧基硅烷、乙基三甲氧基硅、丙基三甲氧基硅烷及聚二甲基硅氧烷等為前體溶膠凝膠包埋法固定化脂肪酶。由于脂肪酶特殊的 “界面激活”性質(zhì)，所制備的固定化酶其酶活大約是游離酶的10倍，研究者還發(fā)現(xiàn)固定化酶的儲存穩(wěn)定性及操作穩(wěn)定性都有明顯提高。2013年，Hu等[9]以正丙基三甲氧基硅烷和四乙氧基硅烷為前體采用溶膠凝膠包埋法對Candida rugosa脂肪酶進(jìn)行固定化并用于維生素E琥珀酸酯的合成，用橄欖油作為表面活性劑，固定化酶催化維生素E琥珀酸酯合成的酯化活力是游離酶的6.7倍。

3.2.3 交聯(lián)法固定化脂肪酶

交聯(lián)法是使用雙功能或多功能試劑進(jìn)行酶與載體之間或酶分子間的交聯(lián)，從而得到三維交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)脂肪酶的固定化。戊二醛、聯(lián)苯、雙偶氮二聯(lián)苯胺和六甲基二異氰酸等都可作為交聯(lián)劑，其中戊二醛是最常用的一種交聯(lián)劑。在大多數(shù)情況下，酶分子基團(tuán)參與形成共價(jià)鍵實(shí)現(xiàn)酶的固定化，該方法容易引起酶活力損失，甚至可導(dǎo)致酶蛋白變性。在固定化中，交聯(lián)法一般不單獨(dú)使用，通常作為吸附法或包埋法的輔助手段，避免固定化酶的脫落。無載體固定化酶技術(shù)是一種新的酶固定化方法，其主要也是通過交聯(lián)法制備，研究最廣泛的有交聯(lián)酶晶體技術(shù)（CLECs）和交聯(lián)酶聚集體技術(shù)（CLEAs），無載體固定化酶技術(shù)是一種很有前途的固定化方法。Torres等[10]用無載體固定化方法—交聯(lián)酶聚集體技術(shù)（CLEAs）對來源于Thermomyces lanuginosa的脂肪酶（TLL）進(jìn)行固定化研究，以(NH4)2SO4作為沉淀劑，戊二醛作為交聯(lián)劑，優(yōu)化了制備交聯(lián)TLL聚集體的條件，在最適條件下所得固定化酶的最高酶活力回收為75%。

3.2.4 共價(jià)結(jié)合法固定化脂肪酶

共價(jià)結(jié)合法是利用共價(jià)化學(xué)鍵實(shí)現(xiàn)酶蛋白分子上非必需的側(cè)鏈基團(tuán)與載體表面的功能基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合的一種固定化方法。常用的載體包括纖維素、瓊脂糖等天然高分子材料，聚丙烯酰膠、尼龍等人工合成高聚物和多孔玻璃、陶瓷等無機(jī)載體。共價(jià)結(jié)合法往往載體與酶結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好，有利于連續(xù)使用，但是共價(jià)結(jié)合反應(yīng)條件苛刻，易破壞酶分子的活性中心，從而所得固定化酶活力不高。Chiou等[11]采用碳二亞胺偶聯(lián)劑對殼聚糖載體進(jìn)行活化，用于固定化Candida rugosa脂肪酶，研究結(jié)果表明，潮濕的殼聚糖顆粒作為載體具有更好的催化性能，用于棕櫚酸對硝基苯酯的水解反應(yīng)連續(xù)使用10個(gè)批次后酶活剩余85%。

4 有機(jī)相中脂肪酶催化技術(shù)的應(yīng)用

4.1 脂肪酸酯的合成

脂肪酶作為一類可在有機(jī)相中催化酯合成、酯交換等反應(yīng)的重要生物催化劑，其作用越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，已廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥、及食品等領(lǐng)域。2003年劉長波等[12]使用不同脂肪酶作為生物催化劑，在有機(jī)相體系中催化合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯，確定了最佳的生物催化劑及生物催化反應(yīng)體系。2008年李宏亮等[13]在含水量為0.2%的石油醚體系中催化合成了維生素A棕櫚酸酯；2013年Jiang等[14]以Candida rugosa脂肪酶為生物催化劑，在有機(jī)介質(zhì)中合成維生素E琥珀酸酯。

4.2 食品工業(yè)

在現(xiàn)代食品工業(yè)領(lǐng)域脂肪酶是不可或缺的生物催化劑，在油脂改性方面脂肪酶可催化一種酯與另一種脂肪酸、醇、酯發(fā)生酯交換反應(yīng)，改變油脂的性質(zhì)，Chang等[15]以正己烷為有機(jī)相催化反應(yīng)體系，以氫化的棉籽油和菜籽油為底物，固定化脂肪酶催化兩種底物進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，產(chǎn)物的熔點(diǎn)較天然可可脂高36°C，可作為可可脂的替代品；固定化脂肪酶也被用于芳香酯的合成，固定化Staphylococcus warneri和Staphylococcus xylosus脂肪酶被用于生產(chǎn)風(fēng)味酯。

4.3 制藥工業(yè)

近年來隨著手性技術(shù)的興起，脂肪酶催化工藝在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用成為最活躍的研究領(lǐng)域之一，脂肪酶的生物催化反應(yīng)具有催化活性高，較強(qiáng)的專一性，較強(qiáng)的選擇性，對環(huán)境沒有污染等絕對的優(yōu)勢。在手性藥物拆分上發(fā)現(xiàn)脂肪酶具有一定的優(yōu)勢，布洛芬、萘普生、酮洛芬等一系列抗炎鎮(zhèn)痛類藥物因?yàn)橛惺中灾行拇嬖趯τ丑w，對這一類藥物進(jìn)行生產(chǎn)工藝合成優(yōu)化，取得了比較理想的效果。脂肪酶催化藥物在抗菌藥物、抗腫瘤藥物和抗抑郁藥物的合成方面也發(fā)揮了一定的作用。

4.4 新能源

以脂肪酶為生物催化劑可用于生物柴油的合成，由動植物油脂與短鏈的醇（甲醇或乙醇）通過脂肪酶進(jìn)行酯交換反應(yīng)得到脂肪酸單烷基酯，最常用的脂肪酶來源于Pseudomonas cepacia。王學(xué)偉等[16]利用自制的酶柱反應(yīng)器，以大豆油和甲醇為底物，在固定化脂肪酶催化下進(jìn)行酯交換反應(yīng)，成功制備得到生物柴油，對合成工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，產(chǎn)物中主要脂肪酸甲酯的含量可以達(dá)到91.87%。但是在含有高濃度甲醇的反應(yīng)體系中，脂肪酶往往易失活，限制了酶在生物柴油工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用，因此耐極性有機(jī)溶劑脂肪酶的篩選成為一個(gè)研究方向和熱點(diǎn)。

5 展望

有機(jī)相中脂肪酶的生物催化反應(yīng)已成為非水酶學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要分支，并在醫(yī)藥、食品等生產(chǎn)領(lǐng)域進(jìn)行了廣泛應(yīng)用[17]。雖然將脂肪酶運(yùn)用于有機(jī)相中的生物催化反應(yīng)具有多種優(yōu)勢，但是有機(jī)溶劑對酶活及酶穩(wěn)定性的不利影響仍然存在，基于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的耐有機(jī)溶劑脂肪酶的篩選及改造已逐漸成為研究的熱點(diǎn)，將有力促進(jìn)脂肪酶在有機(jī)相合成中的應(yīng)用。另外，脂肪酶的固定化除了傳統(tǒng)固定化方法的應(yīng)用，開發(fā)新的固定化技術(shù)也將推動有機(jī)相催化反應(yīng)在工業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。

[1]LOUSA D,BAPTISTA A M,SOARES C M.A molecular perspective on nonaqueous biocatalysis:contributions from simulation studies[J].Physical Chemistry Chemical Physics,2013,15(33):13723-13736.

[2]ZAKS A,KLIBANOV A M.The effect of water on enzyme action in organic media[J].Journal of Biological Chemistry,1988,263(17):8017-8021.

[3]HERBST D,PEPER S,Niemeyer B.Enzyme catalysis in organic solvents:influence of water content,solvent composition and temperature on Candida rugosa lipase catalyzed transesterification[J].Journal of Biotechnology,2012,162(4):398-403.

[4]CHEN Jyhping.Production of ethyl butyrate using gel-entrapped Candida cylindracea lipase[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1996,82(4):404-407.

[5]YIN Chunhua,LIU Tao,TAN Tianwei.Synthesis of vitamin A esters by immobilized Candida sp.lipase in organic media[J].Chinese Journal of Chemical Engineering,2006,14(1):81-86.

[6]KHARRAT N,ALI Y B,MARZOUK S,et al.Immobilization of Rhizopus oryzae lipase on silica aerogels by adsorption:comparison with the free enzyme[J].Process Biochemistry,2011,46(5):1083-1089.

[7]HERNANDEZ K,GARCIA-GALAN C,FERNANDEZ-LAFUENTE R.Simple and efficient immobilization of lipase B from Candida antarctica on porous styrene-divinylbenzene beads[J].Enzyme and Microbial Technology,2011,49(1):72-78.

[8]REETZ M T,ZONTA A,SIMPELKAMP J.Efficient immobilization of lipases by entrapment in hydrophobic sol-gel materials[J].Biotechnology and Bioengineering,1996,49(5):527-534.

[9]HU Yi,JIANG Xiangjun,WU Suwen,et al.Synthesis of vitamin E succinate by interfacial activated Candida rugosa lipase encapsulated in sol-gel materials[J].Chinese Journal of Catalysis,2013,34(8):1608-1616.

[10]TORRES M P G,FORESTI M L,FERREIRA M L.Effect of different parameters on the hydrolytic activity of cross-linked enzyme aggregates(CLEAs)of lipase from Thermomyces lanuginosa[J].Biochemical Engineering Journal,2013,72:18-23.

[11]CHIOU Shaohua,WU Wenteng.Immobilization of Candida rugosa lipase on chitosan with activation of the hydroxyl groups[J].Biomaterials,2004,25(2):197-204.

[12]劉長波，高瑞昶．非水相酶催化合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯[J]．化學(xué)工業(yè)與工程，2003，20(6)：444-447．

[13]李宏亮，胡晶，譚天偉．固定化脂肪酶合成維生素A棕櫚酸酯[J]．生物工程學(xué)報(bào)，2008，24(5)：817-820．

[14]JIANG Xiangjun,HU Yi,JIANG Ling,et al.Synthesis of vitamin E succinate from Candida rugosa lipase in organic medium[J].Chemical Research in Chinese Universities,2013,29(2):223-226.

[15]CHANG M K,ABRAHAM G,JOHN V T.Production of cocoa butter-like fat from interesterification of vegetable oils[J].Journal of the American Oil Chemists’Society,1990,67(11):832-834.

[16]王學(xué)偉，常杰，呂鵬梅，等．固定化脂肪酶催化制備生物柴油[J]．石油化工，2005，34(9)：855-858．

[17]徐明，付會兵，劉鵬，等．畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶條件的研究[J]．發(fā)酵科技通訊，2015，4(1):33-37.