李蘭，張洪友*，夏成，于永忠，魏玉華，高陽，錢偉東，牛聰（.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶6339；.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶6339）

奶牛孕酮單克隆抗體的制備及其鑒定

李蘭1，張洪友1*，夏成1，于永忠2，魏玉華2，高陽1，錢偉東1，牛聰1
（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶163319）

國內(nèi)外研究表明通過對奶牛血液及乳汁中孕酮水平的檢測能有效的用于奶牛發(fā)情鑒定、妊娠診斷及繁殖障礙性疾病的監(jiān)測。本研究旨在制備鼠抗孕酮單克隆抗體，為奶牛孕酮免疫學(xué)檢測技術(shù)提供研究基礎(chǔ)。實驗采用碳化二亞胺方法合成孕酮完全抗原，經(jīng)SDS-PAGE電泳及紫外分光光度計掃描鑒定，結(jié)果表明孕酮免疫抗原（P4-BSA）及檢測抗原（P4-OVA）合成制備成功。乳化后的P4-BSA經(jīng)皮下免疫小鼠，三免后血清效價可達到1∶64000。采用聚乙二醇化學(xué)融合方法進行細胞融合，間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞株，最終獲得一株能穩(wěn)定分泌IgG1型抗孕酮單克隆抗體的雜交瘤細胞株，誘生的腹水經(jīng)辛酸硫酸純化制備，抗體的特異性較好。

孕酮；抗原制備；單克隆抗體；腹水

近年來，隨著我國奶業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，在奶牛產(chǎn)量提高的同時其繁殖能力卻有所下降，因此對奶牛繁殖性能的檢測及評估顯得尤為重要［1］。目前，直腸觸診和超聲檢測仍是奶牛早期妊娠診斷的主要技術(shù)，而直腸觸診通常在人工授精2個月后才能確診，同時直腸觸診也會對奶牛產(chǎn)生應(yīng)激、對子宮會造成感染，而且對工作人員要求較高。有報道稱，通過孕酮含量的測定可以監(jiān)測動物的卵巢功能、妊娠和繁殖，減少空懷可以提高動物的繁殖率，增加其經(jīng)濟效益［2］。孕酮屬于甾體類激素，主要由黃體和胎盤產(chǎn)生，腎上腺皮質(zhì)、睪丸和排卵前的卵泡也能產(chǎn)生少量的孕酮。動物臨床上多應(yīng)用少量孕酮和雌激素共同發(fā)生作用對生殖系統(tǒng)進行調(diào)控，達到促進動物發(fā)情或治療繁殖障礙性疾病的目的［3］。孕酮在體內(nèi)主要調(diào)控生殖系統(tǒng)，尤其在母畜懷孕早期表現(xiàn)最明顯，主要是為妊娠做準備，識別并維持妊娠。母畜一旦妊娠，體中孕酮含量會明顯增加，為受精卵著床、胚胎發(fā)育創(chuàng)造條件。孕酮的含量直接反映黃體的活動。研究表明，奶牛在發(fā)情期、間情期時孕酮濃度多低于3 ng/mL，而在黃體及妊娠期奶牛乳中的孕酮可高達20 ng/mL［4-5］。本實驗旨在制備孕酮單克隆抗體，為診斷試劑盒研制奠定基礎(chǔ)，為奶牛發(fā)情鑒定和早期妊娠診斷提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑及實驗動物孕酮-11α-半琥珀酸脂（11α-OH-P4-HS）購自Fitgerald公司，二甲基甲酰胺（DMF）、二環(huán)己基碳化二亞胺（DCC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA）購自SIGMA公司。卵清白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）、透析袋購自鼎國生物公司，96孔可拆酶標反應(yīng)板購自美國康寧公司。胎牛血清購自杭州四季青，50倍HAT和50倍HT均購自SIGMA公司。10只6～8周齡雄性BALB/c小鼠購自長春生物制品研究所實驗動物中心。NanoDrop 2000/2000c紫外-可見分光光度計。

1.2 免疫抗原和檢測抗原的制備與鑒定鑒于孕酮為小分子甾體類激素，不具有免疫原性。本研究采用碳化二亞胺方法將11α-OH-P4-HS分別偶聯(lián)BSA和OVA制備免疫抗原和檢測抗原制備［8-10］。取1 mg 11α-羥基孕酮半琥珀酸（11α-OH-P4-HS）溶解于0.02 mL二甲基甲酰胺（DMF）中；再分別取0.029 8 mg N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和0.534 mg二環(huán)己基碳化二亞胺（DCC），各自溶于0.004 mL DMF中；將3種溶液混合，振蕩90 min；將振蕩均勻后的溶液緩慢逐滴加入2.1 mg OVA（溶于pH 7.0磷酸鹽緩沖液（PB））用于制備P4-OVA或逐滴加入3.2 mg BSA（溶于pH 7.0磷酸鹽緩沖液）用于制備P4-BSA，4℃攪拌過夜。對偶聯(lián)的液體于PBS中透析15 h，期間換液3次，透析后的偶聯(lián)物，4 000 r/min，離心30 min，取上清分裝，在-20℃凍存?zhèn)洹Ｅ悸?lián)后的抗原分別經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定及NanoDrop 2000/2000c紫外-可見分光光度計進行掃描分析。

1.3 動物免疫本研究選用P4-BSA為免疫抗原，對6～8周齡BALB/c小鼠進行免疫，首次免疫劑量50 μg與等體積的福氏完全佐劑進行乳化，頸背部皮下分點注射。首免21 d后進行加強免疫，50 μg P4-BSA與等體積的福氏不完全佐劑乳化后進行頸背部皮下免疫，間隔進行，第3次加強免疫10 d后斷尾采血分離血清，間接ELISA檢測抗孕酮多克隆抗體（pAb）效價，挑選效價高的小鼠為融合備用鼠。

1.4 細胞融合和雜交瘤細胞株的篩選［11-12］融合前7 d復(fù)蘇sp2/0細胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)，選取細胞生長旺盛，邊緣透亮，形態(tài)良好細胞用于融合。細胞融合前3 d對小鼠腹腔注射50 μg不加佐劑的P4-BSA進行加強免疫。融合前1 d，取一只未經(jīng)免疫的BALB/c小鼠摘眼球采血，并拉頸處死，無菌操作取腹腔巨噬細胞制備含1%HAT飼養(yǎng)層細胞用于雜交瘤細胞培養(yǎng)。取加強免疫3 d后小鼠，無菌取出小鼠脾臟于無菌濾網(wǎng)上研磨，收集脾細胞并計數(shù)。將經(jīng)過細胞計數(shù)后的脾細胞和Sp2/0細胞按5～6∶1的比例混合，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清進行細胞融合［7］。在37℃水浴條件下在1 min內(nèi)向細胞內(nèi)加入1 mL PEG1450，邊加邊搖使其與細胞混勻，靜置90 s后，1640培養(yǎng)液終止融合反應(yīng)，具體做法是第1 min加1 mL，第2 min加1 mL，第3 min加2 mL，邊加邊輕輕轉(zhuǎn)動離心管，隨后3 min內(nèi)再加RPMI-1640不完全培養(yǎng)液21 mL。1 000 r/min離心8 min，棄上清，37℃預(yù)熱的1%HAT選擇培養(yǎng)液輕懸細胞沉淀，以100 μL/孔滴加到含有飼養(yǎng)層細胞的96孔培養(yǎng)板中，于37℃，5%CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 陽性雜交瘤細胞株的篩選細胞融合第6天時用HAT培養(yǎng)液對細胞進行半換液，第11天時抽取細胞上清用間接ELISA方法進行陽性細胞株的篩選，將陽性孔細胞轉(zhuǎn)至24孔板中培養(yǎng)，7 d后抽取上清再次用間接ELISA方法篩選。陽性孔細胞進行有限稀釋克隆化，細胞計數(shù)后用含有HT的培養(yǎng)液稀釋后滴加到96孔板中培養(yǎng)，使每孔中含有1～1.5個細胞。7 d后抽取細胞上清進行篩選克?。ㄖ钡?6孔板中克隆的細胞全部成陽性細胞），擴大培養(yǎng)后將其凍存一部分，其余的繼續(xù)培養(yǎng)制備腹水。

1.6 陽性孔特異性鑒定篩選出的細胞上清與OVA、BSA、P4-OVA進行間接競爭ELISA實驗。

1.7 腹水制備及其純化采用體內(nèi)誘生腹水法制備腹水。選擇產(chǎn)過幼仔的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射1 mL石蠟，一周后，將雜交瘤細胞按2×105～6× 105注入小鼠腹腔誘生腹水，7～10 d后收集腹水。采用鼠源McA b亞類鑒定試劑盒對腹水進行IgG亞類鑒定。采用辛酸-飽和硫酸銨沉淀法對腹水進行初步純化。收集腹水12 000 r/min離心15 min，去除雜質(zhì)。1份腹水與2份醋酸鹽緩沖液混合，室溫攪拌后按稀釋前1 mL再加33 μL/mL正辛酸。室溫混合30 min后4℃初靜置2 h，之后再4℃10 000 r/min離心50min，棄沉淀取上清。將pH值調(diào)至7.4。然后加等體積的飽和硫酸銨充分混勻4℃過夜，次日4℃10 000 r/min離心30 min棄上清，用PBS沖懸沉淀。4℃透析過夜。純后的腹水進行Western blot鑒定。

2 結(jié)果

制備的完全抗原經(jīng)紫外-可見分光光度計分析，結(jié)果見圖1。載體蛋白BSA在278 nm波長處出現(xiàn)強吸收峰，半抗原11α-OH-P4-HS最大吸收波長為248 nm。偶聯(lián)的免疫抗原P4-BSA紫外吸收曲線與半抗原和載體蛋白的紫外吸收曲線圖形和趨勢都不同，同時從圖3可以看出偶聯(lián)物經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示P4-BSA略大于BSA，由此可說明偶聯(lián)反應(yīng)后，載體蛋白的分子量略有增加，證明偶聯(lián)成功。

圖1 P4-BSA的紫外掃描譜圖

圖2同圖1一樣，偶聯(lián)的紫外吸收曲線與半抗原和載體蛋白的紫外吸收曲線圖形和趨勢都不同，圖3 SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果也顯示P4-OVA略大于OVA，證明偶聯(lián)成功。

圖2 P4-OVA的紫外掃描譜圖

圖3 偶聯(lián)物SDS-PAGE電泳圖

2.2 間接ELISA檢測方法的建立抗原和抗體經(jīng)稀釋后進行ELISA檢測，結(jié)果如表1所示。在抗原以1：800稀釋，陰性血清和陽性血清以1∶1 000稀釋時，P/ N值最大，為12.95。OD450mm值接近1。因此確定抗原以1∶800稀釋包被酶標板，且血清以1∶1 000稀釋作為對照間接ELISA檢測方法的最佳工作條件。

2.3 雜交瘤細胞株篩選間接ELISA方法測定第3次免疫10 d后小鼠血清效價可達1：64 000（見表1），選擇免疫效果較好的小鼠腹腔注射P4-PBS加強免疫。采用聚乙二醇化學(xué)融合方法進行細胞融合，共篩選出2株陽性雜交瘤細胞株（1F11和2B6）。其中2B6隨著擴大培養(yǎng)和克隆篩選細胞狀態(tài)逐漸變差。1F11細胞株直到第4次克隆仍具有穩(wěn)定的陽性值。

表1 小鼠第3次免疫檢測效價結(jié)果

2.2.4 細胞株特異性的鑒及亞類鑒定間接ELISA法測定1F11細胞株上清液與OVA和BSA交叉反應(yīng)結(jié)果（見表2），當OVA和BSA包被酶標后，間接ELISA法測定結(jié)果P/N值均小于2.1，為陰性反應(yīng)，表明篩選出的雜交瘤細胞株與OVA和BSA均無交叉反應(yīng)。擴大培養(yǎng)后的1F11細胞株注入小鼠腹腔誘生腹水，腹水經(jīng)鼠源McAb亞類鑒定試劑盒分析結(jié)果顯示1F11為IgG1亞類（表3）。

表2 單克隆抗體特異性檢測結(jié)果

表3 單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果

2.2.4 抗體特異性鑒定P4-BSA和BSA蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，腹水初步純化后為一抗，DAB顯色后，P4-BSA在67～70 ku出現(xiàn)清晰條帶，BSA處無條帶，結(jié)果表明抗體識別P4-BSA蛋白。

圖4 單克隆抗體的Western blot鑒定

3 討論

正常免疫小鼠如果沒有特殊要求一般選用雌性Balb/c小鼠，但本實驗為了減少雌性小鼠自身孕酮影響，故改用雄性小鼠。鑒于孕酮為小分子抗原，本研究利用碳化二亞胺方法制備了孕酮完全抗原。鑒定完全抗原是否偶聯(lián)成功常用SDS-PAGE和紫外光譜掃描。將半抗原連接到載體蛋白上經(jīng)UV掃描，吸收強度會發(fā)生變化。SDS-PAGE能定性判斷半抗原是否偶連到載體蛋白上［13］。本實驗經(jīng)2種方法鑒定結(jié)果表明完全抗原合成成功。對于小分子抗體的制備，建議免疫程序最好選擇大劑量長期免疫，能夠獲得較好的免疫效果。本實驗融合陽性率不高，可能與操作手法不嫻熟、試驗器材選擇有關(guān)，融合細胞建議選擇進口血清。雖然雜交瘤細胞融合技術(shù)業(yè)已成熟，但仍有多方面因素像細胞的融合率，但本研究發(fā)現(xiàn)融合過程中操作程序的規(guī)范性、操作手法嫻熟度、實驗材料質(zhì)量的差別都會影響到細胞的融合率。本實驗經(jīng)3次融合及有限稀釋亞克隆獲得陽性率較好的雜交瘤細胞株1株，對于克隆后的細胞選擇生長良好進行凍存，避免細胞污染丟失細胞株。辛酸硫酸銨法主要用于IgG2b和IgG1的純化，對于IgGA和IgG3的純化效果并不好［14］。本實驗抗體亞類鑒定為IgG1，粗純化后的腹水效價可達到1.02×106，Protein G純化試劑盒純化的抗體應(yīng)該具有制備檢測孕酮試劑盒的特性，孕酮單克隆抗體的制備為檢測乳牛體中孕酮含量奠定一定的基礎(chǔ)。本研究在其診斷方面有了進一步的提高。

4 結(jié)論

綜上所述，應(yīng)用碳化二亞胺將半抗原和OVA、BSA偶聯(lián)，并經(jīng)紫外分光光度計掃描和SDA-PAGE鑒定偶聯(lián)成功。將抗原免疫小鼠，小鼠效價達到1∶64 000，經(jīng)進行細胞融合獲得了1株穩(wěn)定分泌抗孕酮的細胞株，命名為1F11。McAb亞類為IgG1型，具有良好的特異性。

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S823

：A

：0258-7033（2015）19-0063-04

2014-12-13；

2015-02-23

黑龍江省科技攻關(guān)項目（GC0313708）；國家科技部項目（2013BAD21B01-2）；黑龍江省人才項目（1252-NCET-003）

李蘭（1988-），女，黑龍江蘿北縣人，在讀研究生，E-mail：253822337@qq.com

*通訊作者：張洪友，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，獸醫(yī)臨床內(nèi)科學(xué)，E-mail：zhy478@163.com