鄒靈秀，鄧彥飛，陳鳳，喬樹葉，楊素芳，石德順（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005）

水牛轉(zhuǎn)錄因子Sox2和Lin28克隆與表達(dá)研究

鄒靈秀，鄧彥飛*，陳鳳，喬樹葉，楊素芳，石德順*
（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005）

本研究克隆水牛特異性轉(zhuǎn)錄因子Sox2和Lin28，構(gòu)建表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究2個(gè)基因在水牛干細(xì)胞多能性調(diào)控中的作用奠定基礎(chǔ)。以胎牛生殖嵴總RNA為模版，采用RT-PCR擴(kuò)增Sox2和Lin28的編碼區(qū)序列（CDS），構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pMSCV-Sox2和pMSCV-Lin28，轉(zhuǎn)入NIH3T3細(xì)胞，鑒定其表達(dá)情況。結(jié)果表明：水牛Sox2和Lin28的CDS全長(zhǎng)分別為966 bp和618 bp，蛋白結(jié)構(gòu)保守；Sox2、Lin28氨基酸序列與牛、豬、人和鼠相應(yīng)氨基酸序列的相似性分別為96%、95%、94%、94%和98%、97%、89%和91%；pMSCV介導(dǎo)的Sox2和Lin28能在NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)。

水牛；轉(zhuǎn)錄因子；克??；真核表達(dá)

家畜干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和建立干細(xì)胞系可以為家畜育種改良研究提供細(xì)胞資源。利用水牛干細(xì)胞介導(dǎo)的定點(diǎn)整合轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)遺傳性狀優(yōu)良的水牛新品種是解決低繁殖力、低產(chǎn)奶量等遺傳缺陷的重要手段之一。對(duì)水牛干細(xì)胞多能性相關(guān)基因及其信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究，可以建立水牛干細(xì)胞系。Sox2和Lin28是與干細(xì)胞多能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在維持干細(xì)胞自我更新和多能性的作用中發(fā)揮重要作用，與Oct4和Nanog等構(gòu)成干細(xì)胞調(diào)控通路的核心轉(zhuǎn)錄因子［1］。

Sox2主要在干細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，敲除Sox2的早期胚胎，會(huì)因?yàn)樯吓邔影l(fā)育受阻而死亡，或者不能分離形成胚胎干細(xì)胞［2］。Lin28是一個(gè)RNA結(jié)合蛋白，可以提高某些特異mRNAs的穩(wěn)定性，在早期胚胎和胚胎干細(xì)胞中高表達(dá)，在分化的細(xì)胞中低表達(dá)［3］。Yu等［4］采用Sox2、Lin28結(jié)合Oct4和Nanog 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，將人類成纖維細(xì)胞重編程成為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs），充分顯示了Sox2和Lin28在干細(xì)胞多能性調(diào)控中的重要作用。目前，Sox2和Lin28基因編碼區(qū)的克隆研究在小鼠［1］、人［2］、羊［5］和豬［6］等物種上有相關(guān)報(bào)道，在水牛上尚未有報(bào)道。本研究克隆和分析水牛Sox2和Lin28基因的CDS序列，構(gòu)建表達(dá)載體，并在NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)，為水牛iPSCs的生產(chǎn)以及轉(zhuǎn)錄因子在水牛干細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑配方水牛胎兒（3月齡左右）取自南寧市屠宰場(chǎng)；E.coli DH5α感受態(tài)菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存；pMSCV載體系統(tǒng)購(gòu)自Clontech公司；NIH3T3細(xì)胞購(gòu)自ATCC公司；pMD18-T克隆載體、Taq酶、內(nèi)切酶（EcoRⅠ和XhoⅠ）和T4連接酶等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；感受態(tài)細(xì)胞和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Transgen；DNA Marker、RNA提取試劑盒、瓊脂糖、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；質(zhì)粒去內(nèi)毒提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN；胎牛血清（FBS）、DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS緩沖液、青鏈霉素和G418等購(gòu)自Gibco公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試LTX劑購(gòu)自Life公司；引物合成和序列測(cè)定在上海生工進(jìn)行。

DNA序列分析使用NCBI/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)；引物設(shè)計(jì)使用Oligo 6.0引物設(shè)計(jì)軟件；序列拼接使用DNA Star/SeqMan軟件；同源性分析使用Clustalx和Blast軟件；蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)使用SMART在線分析軟件；進(jìn)化樹分析和繪制使用DNAMAN軟件。

1.2 RT-PCR克隆Sox2和Lin28編碼區(qū)獲取胎牛生殖嵴，采用RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA（反轉(zhuǎn)錄條件：25℃10 min，42℃30 min，90℃5 min，4℃forever）。根據(jù)GenBank上報(bào)道的各物種Sox2和Lin28的基因序列，分別經(jīng)過(guò)多重比較。Sox2參照牛（NM001105463.1）、豬（EU503117.1）的序列，Lin28參照豬（NM_001123133.1）、羊（KC994650.1）的序列，分別設(shè)計(jì)特異性引物，以cDNA為模板擴(kuò)增水牛Sox2和Lin28的編碼區(qū)（Sox2F-GAATTC ATGTACAACATGATGGAGACG，Sox2R-CTCGAGTCA CATGTGCGAGAGGGGC退火溫度為62℃，下劃線分別為EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)；LinF-GAATTCATG GGCTCTGTGTCAAACCAG，LinR-CTCGAGTCAATTCTG GGCCTCTGGGAG，退火溫度為62℃，下劃線分別為EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。將目的片段經(jīng)過(guò)膠回收純化之后，分別連接到pMD18-T載體上，測(cè)序驗(yàn)證后，最終獲得pMD18-T-Sox2和pMD18-T-Lin28重組質(zhì)粒。1.3pMSCV表達(dá)載體的構(gòu)建將pMD18-T-Sox2和pMD18-T-Lin28均采用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切；膠回收純化后，用T4連接酶，將Sox2和Lin28分別連接到同樣采取相同內(nèi)切酶酶切后的pMSCV載體上；經(jīng)過(guò)大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，采用無(wú)內(nèi)毒素試劑盒提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，最終獲得表達(dá)Sox2和Lin28的重組質(zhì)粒（pMSCV-Sox2和pMSCV-Lin28），-20℃保存供細(xì)胞轉(zhuǎn)染用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)將NIH3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系在37℃水浴鍋中解凍，接種到60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)。NIH3T3完全培養(yǎng)基為DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清（FBS）、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL。采用濃度為2.5 mg/mL的胰酶消化傳代。

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞將NIH3T3細(xì)胞接種到60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿上，待細(xì)胞生長(zhǎng)到70%左右匯合度時(shí)，使用LTX脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。pMSCV-Sox2和pMSCV-Lin28重組質(zhì)粒分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前4 h改換無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM 3 mL。轉(zhuǎn)染具體步驟如下：在1 mL無(wú)血清無(wú)雙抗DMEM中加入5 μg重組質(zhì)粒和7.5 μL Plus，混勻；室溫孵育5 min，加入10 μL LTX，混勻，室溫孵育30 min后滴加到包裝細(xì)胞培養(yǎng)皿里；4～6 h后改換DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選和表達(dá)鑒定NIH3T3轉(zhuǎn)入目的基因24 h后，將細(xì)胞按照1∶4的比例進(jìn)行傳代，同時(shí)在完全培養(yǎng)基中加入250 μg/mL G418對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行篩選。經(jīng)過(guò)2～3周的篩選后，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用RT-PCR檢測(cè)Sox2和Lin28基因在NIH3T3中mRNA的表達(dá)情況。收集陽(yáng)性細(xì)胞，PBS洗3次，分別提取RNA，DpnⅠ消化殘留DNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板，使用下列引物進(jìn)行擴(kuò)增：Sox2 F：CAACTCGGAGATCAGCAAGC；Sox2 R：GTTCA TGTAGGTCTGCGAGC（退火溫度60℃；擴(kuò)增長(zhǎng)度454bp）；Lin28 F：GGTTCGGCTTCCT GTCCATGA；Lin28 R：CAGT TTGCATTCCTTGGCATGAT（退火溫度64℃，擴(kuò)增長(zhǎng)度307 bp）。未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因操作的NIH3T3總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物采用凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sox2和Lin28基因的克隆以水牛生殖嵴來(lái)源的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，擴(kuò)增Sox2和Lin28的編碼區(qū)序列全長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)凝膠電泳后，成像系統(tǒng)顯示Sox2基因編碼區(qū)條帶大小為966 bp，Lin28基因編碼區(qū)條帶大小為618 bp（圖1）。將Sox2和Lin28連接到pMD-18T載體上，獲得重組載體pMD18-T-Sox2和pMD18-TLin28，經(jīng)過(guò)酶切鑒定后獲得相應(yīng)大小的目的片段（圖2）。Sox2和Lin28經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證后提交到GenBank，分配的基因序列號(hào)分別為Sox2：JN986576，Lin28：JN986575。

圖1 Sox2和Lin28基因的擴(kuò)增

2.2 Sox2和Lin28基因序列分析使用在線生物軟件SMART分析水牛Sox2和Lin28序列的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，水牛Sox2含有其家族特有的HMG結(jié)構(gòu)域和3個(gè)低重復(fù)序列，Lin28含有冷休克蛋白結(jié)構(gòu)域（CSP）和2個(gè)C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)域。對(duì)水牛Sox2和Lin28氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列與牛、豬、人和鼠相應(yīng)蛋白高度保守，Sox2、Lin28相似性分別為96%、95%、94%、94%（圖4）和98%、97%、89%、91%（圖5）。

2.3 表達(dá)Sox2和Lin28重組表達(dá)載體的構(gòu)建將pMD18-T-Sox2和pMD18-T-Lin28載體經(jīng)過(guò)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收Sox2和Lin28片段，連接到經(jīng)過(guò)相同雙酶切的pMSCV載體上，獲得重組表達(dá)載體pMSCV-Sox2和pMSCV-Lin28。最后經(jīng)過(guò)雙酶切鑒定，獲得預(yù)期大小的目的片段（圖6）。

圖2 pMD18-T-Sox2/Lin28載體構(gòu)建和酶切鑒定

圖4 水牛Sox2進(jìn)化樹分析

圖5 水牛Lin28進(jìn)化樹分析

2.4 表達(dá)Sox2和Lin28細(xì)胞克隆的鑒定采用脂質(zhì)體法，將pMSCV-Sox2和pMSCV-Lin28分別轉(zhuǎn)入NIH3T3細(xì)胞，G418篩選陽(yáng)性克隆。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)2～3周的篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，可以獲得表達(dá)Sox2和Lin28的NIH3T3細(xì)胞克隆。挑選和擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞克隆，RT-PCR鑒定外源基因的表達(dá)，結(jié)果表明所篩選的陽(yáng)性克隆在mRNA水平上表達(dá)Sox2和Lin28（圖7）。

3 討論

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)的誕生給建系困難的家畜干細(xì)胞提供了獲取干細(xì)胞的新方式。目前已經(jīng)報(bào)道的家畜誘導(dǎo)多能干細(xì)胞包括豬［6］、羊［7］和牛［8］等，尤其來(lái)源于豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞嵌合體后代［9］和克隆豬［10］的誕生，給家畜誘導(dǎo)多能干細(xì)胞運(yùn)用于動(dòng)物種質(zhì)資源改良技術(shù)提供有力證據(jù)。本研究克隆和分析誘導(dǎo)多能干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Sox2和Lin28，構(gòu)建重組表達(dá)載體，并在NIH3T3細(xì)胞中成功表達(dá)，這些研究將為水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的生產(chǎn)和研究相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在水牛干細(xì)胞中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

圖6 pMSCV-Sox2/Lin28表達(dá)載體的構(gòu)建和酶切鑒定

圖7 陽(yáng)性克隆的篩選和表達(dá)鑒定

Sox2是Sox（SRY-related HMG box-containing）基因家族的一員，含有該家族保守的HMG box結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合特異性的DNA序列。Sox2是一個(gè)與干細(xì)胞多能性相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，降低胚胎干細(xì)胞中Sox2的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞分化。與胚胎干細(xì)胞多能性維持相關(guān)的基因受到Sox2的調(diào)控，如Sox2的HMG結(jié)構(gòu)域和Oct4的POU結(jié)構(gòu)域共同結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)，形成HMG/POU/DNAs三元復(fù)合物，調(diào)控靶基因的表達(dá)［11］。Lin28是一種保守的RNA結(jié)合蛋白（RBP），可以提高特殊mRNAs的穩(wěn)定性，使其在組織中穩(wěn)定表達(dá)。Lin28的結(jié)構(gòu)保守，含有冷休克結(jié)構(gòu)域（CSD）和一對(duì)反向的CCHC鋅指結(jié)構(gòu)域（ZFM）。Lin28可以通過(guò)抑制let-7來(lái)調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新，Lin28/ let-7通路參與干細(xì)胞功能和腫瘤發(fā)生［12］。Sox2和Lin28的相互作用，除了能結(jié)合其他轉(zhuǎn)錄因子將體細(xì)胞重編程為iPSCs，共同維持干細(xì)胞特性之外，在神經(jīng)細(xì)胞形成中也有作用。Sox2-Lin28/ let-7通路可以調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和促進(jìn)神經(jīng)的形成［13］。

本研究發(fā)現(xiàn)，水牛Sox2和Lin28與其他物種Sox2和Lin28基因在基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性，其中Sox2含有HMG box結(jié)構(gòu)域、無(wú)內(nèi)含子（只有一個(gè)外顯子），Lin28含一個(gè)冷休克蛋白結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)CCHC型鋅指結(jié)構(gòu)域。在克隆水牛Sox2的過(guò)程中，由于編碼區(qū)GC含量偏高（66.36%），影響到PCR擴(kuò)增效率，因此本研究PCR體系中采用GC buffer（Takara）可以獲得目的片段。另外，在前期研究結(jié)果已經(jīng)表明pMSCV載體系統(tǒng)攜帶EGFP（綠色熒光蛋白）所生產(chǎn)的病毒可以感染NIH3T3［14］。本研究使用MSCV骨架構(gòu)建表達(dá)Sox2和Lin28的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，經(jīng)過(guò)病毒包裝后感染NIH3T3，并篩選出相應(yīng)的陽(yáng)性克隆細(xì)胞系。

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Cloning and Expression of Buffalo Transcription Factors Sox2 and Lin28

ZOU Ling-xiu，DENG Yan-fei*，CHEN Feng，QIAO Shu-ye，YANG Su-fang，SHI De-shun*
（College of Animal Sciences and Technology，Guangxi University，Guangxi Nanning 530005，China）

Buffalo transcription factors Sox2 and Lin28 were cloned and expressing vectors were constructed.This investigation will provide a good foundation for researching the roles of two genes in pluripotent regulation of buffalo stem cells.The that RNA was extracted from fetus germ ridge，the coding sequences（CDS）of Sox2 and Lin28 were cloned by RT-PCR.The expression retroviral vectors pMSCV-Sox2 and pMSCV-Lin28 were constructed，and transfected into NIH3T3 cells with retrovirus infection，expression of Sox2 and Lin28 were detected by RT-PCR respectively.The results showed that the CDS length of Sox2 and Lin28 were 966 bp and 618bp respectively.The protein structure exhibited high conserved，amino acids sequence exhibited high homology with bovine，pig，human and mouse，the percentage of similarity were 96%，95%，94%，94%respectively for Sox2，and 98%，97%，89%，91%for Lin28. pMSCV retroviral vectors based Sox2 and Lin28 could expressed in the NIH3T3 cells respectively.

buffalo；transcription factors；cloning；eukaryotic expression

S823.2

：A

：0258-7033（2015）19-0059-04

2015-03-23；

2015-04-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31360287）；廣西自然科學(xué)基金（2014GXNSFBA118074）；國(guó)家“863”重大專項(xiàng)（2011AA100607）；教育部博士點(diǎn)基金（20134501120003）

鄒靈秀（1987-），女，重慶市人，碩士，主要從事動(dòng)物免疫學(xué)和微生物學(xué)研究，E-mail：350882935@qq.com

*通訊作者：鄧彥飛（1983-），男，博士，副教授，E-mail：yanfeidun@163.com；石德順（1962-），研究員，博導(dǎo)，E-mail：ardsshi@gxu.edu.cn