苑麗霞，郝敬云，周廣航，薛金愛(ài)，李潤(rùn)植*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801；2.晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西 晉中 030600)

?

新型油料作物亞麻薺種子油脂積累的研究

苑麗霞1，2，郝敬云1，周廣航1，薛金愛(ài)1，李潤(rùn)植1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801；2.晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西 晉中 030600)

亞麻薺(Camelinasativa(L.) Crtz.)是一種新型優(yōu)質(zhì)油料作物，含油量高達(dá)40%以上，其中不飽和脂肪酸亞油酸和亞麻酸占油脂的58%以上，廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)和多種工業(yè)領(lǐng)域。為更深入解析亞麻薺種子油脂合成與積累機(jī)制，測(cè)定了在山西太谷自然條件下，亞麻薺種子形態(tài)發(fā)育、種子含油量、種子脂肪酸組成，以及蛋白質(zhì)合成積累的動(dòng)態(tài)過(guò)程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：發(fā)育早期階段1～16 DAF(days after flowering)的亞麻薺種子高含棕櫚酸、硬脂酸和油酸，但含油量較低；在種子發(fā)育中間階段16～24 DAF，種子油脂迅猛積累，多種長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸含量大幅度提高，在24 DAF每粒平均含油量可達(dá)0.47 mg，含油量達(dá)到26.8%；在種子發(fā)育后期階段24～36 DAF，油脂合成與積累相對(duì)緩慢，由于干燥失水，含油量持續(xù)升高。在36 DAF的時(shí)候與其它組織根、莖、葉等營(yíng)養(yǎng)器官相比，種子中亞油酸和亞麻酸的含量較高，分別是14.8%和41.3%。本文為亞麻薺新種植區(qū)域品種遺傳改良和建立相配套的栽培體系提供科學(xué)參考。

亞麻薺；種子發(fā)育；種子油；脂肪酸；油脂積累

亞麻薺(Camelinasativa(L.) Crantz )是一種十字花科一年生草本植物，起源于歐洲東南地區(qū)和亞洲西南地區(qū),一直是在歐洲許多國(guó)家廣泛種植的一種重要油料作物[1]。亞麻薺具有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，如高產(chǎn)、早熟、對(duì)危害十字花科植物的多數(shù)害蟲(chóng)和病原菌都有很強(qiáng)的抗性，對(duì)不利的環(huán)境條件具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，對(duì)水分和養(yǎng)分的需求也較低，可以在干旱、貧瘠、鹽堿地等邊際土地生長(zhǎng)和種植[2]。

亞麻薺種子含油量可達(dá)36%～47%，約是大豆含油量(18%～22%)的2倍[3]。種子油主要脂肪酸成分包括棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、油酸(18∶1)、亞油酸(18∶2)、亞麻酸(18∶3)、花生酸(20∶0)、二十碳烯酸(20∶1)和芥酸(22∶1)等。亞麻薺種子油突出優(yōu)點(diǎn)是含有多種對(duì)人體有益的不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸和亞麻酸),尤其是高水平的α-亞麻酸(ω-3脂肪酸)，是應(yīng)用于人類營(yíng)養(yǎng)、心血管及大腦等保健和功能食品生產(chǎn)等的珍貴高值脂肪酸[4]。亞麻薺因較高的不飽和脂肪酸含量不僅廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域，更適用于生產(chǎn)生物燃油和潤(rùn)滑劑，是應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域的再生能源物質(zhì)[5,6]。另外，由于亞麻薺生育期僅80～100 d，作為一種重新發(fā)掘的優(yōu)質(zhì)能源作物，現(xiàn)今亞麻薺新種植區(qū)域快速擴(kuò)展，全面評(píng)估在新種植區(qū)域條件下亞麻薺生長(zhǎng)發(fā)育和種子品質(zhì)等農(nóng)藝性狀就成為一項(xiàng)迫切任務(wù)。

我們課題組近年來(lái)在山西太谷新種植地域開(kāi)展了亞麻薺引種、試驗(yàn)、新品種培育和種子油脂代謝工程等研究。本文報(bào)道的有關(guān)亞麻薺優(yōu)良種質(zhì)SC-N16 在山西太谷大田自然條件下種子形態(tài)發(fā)育和種子油脂生物合成積累的研究結(jié)果，將為當(dāng)?shù)貋喡樗j新品種的選育和建立這種新型能源作物在當(dāng)?shù)貎?yōu)化栽培種植和新的耕作體系提供科學(xué)指導(dǎo)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料的種植

亞麻薺種質(zhì)材料選用優(yōu)良SC-N16品種(來(lái)自系統(tǒng)選育)，6月15日播種于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，常規(guī)大田管理。用于分析的種子材料分別取自4、8、12、16、20、24、28、32和36 DAF(花后天數(shù))共 9個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的亞麻薺植株。在36 DAF選取植株幼嫩的根、莖、葉材料，其中根部材料用自來(lái)水反復(fù)沖洗掉表面土層，所有新鮮樣品先在液氮中速凍，然后-80℃保存。用于分析的每份種子和組織材料均為隨機(jī)取材于至少6個(gè)不同的植株。

1.2 種子大小及鮮重測(cè)定

取9個(gè)不同發(fā)育時(shí)期種子樣品各50粒，先用分析天平稱量種子鮮重。而后各樣品隨機(jī)選取30粒種子，在解剖鏡下實(shí)測(cè)種子長(zhǎng)度和寬度。各樣品生物學(xué)重復(fù)至少6次。

1.3 種子總油脂和脂肪酸成分測(cè)定

亞麻薺種子和其他組織樣品的總油脂提取按照Dahmer 等[7,8]方法進(jìn)行。取20～30 mg 亞麻薺種子或組織，研磨成粉末狀，放入6 cm 長(zhǎng)的有蓋玻璃試管,向玻璃管中加入1 mL5%(V/V)硫酸甲醇，同時(shí)以10 μg/10 mg 樣品的標(biāo)準(zhǔn)加入十七烷酸甘油三酯 (C17∶0) 作為內(nèi)標(biāo)，90～95℃ 加熱1.5 h。加入 1 mL 含有0.01% (W/V)丁化羥基甲苯 (BHT) 的己烷，混勻后離心，萃取脂肪酸甲酯(FAMEs)。用HP 5890A氣相色譜儀檢測(cè)各種脂肪酸，檢測(cè)程序中起始溫度設(shè)定為 120℃，氦氣作為運(yùn)載氣體，流速為 10 mL·min-1。色譜儀所測(cè)原始數(shù)據(jù)經(jīng)勻質(zhì)化處理后，按相應(yīng)的公式計(jì)算各脂肪酸含量和總油脂含量。各樣品生物學(xué)重復(fù)至少6次。計(jì)算各樣品脂肪酸含量的平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.4 種子蛋白質(zhì)和水分的測(cè)定

蛋白測(cè)定：利用LECO CHNS-932分析儀，取100粒干燥的亞麻薺種子，通過(guò)元素分析檢測(cè)蛋白含量，以N含量乘以6.25得到總蛋白含量。各樣品生物學(xué)重復(fù)至少6次。水分測(cè)定：將100粒亞麻薺種子鮮樣品進(jìn)行48 h 、80℃干燥處理。測(cè)定干燥處理前后的重量/mg,處理前重量減去干燥處理后的重量即為所測(cè)樣品的種子水分含量。各樣品生物學(xué)重復(fù)至少6次。

所用數(shù)據(jù)都采用DPS 6.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性用t檢驗(yàn)，利用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻薺種子及果實(shí)發(fā)育形態(tài)學(xué)特征

亞麻薺果實(shí)為短角果、呈倒梨形(圖1)，隨著發(fā)育由淺綠(幼果)變?yōu)樯罹G(中期果實(shí))。 從自然脫水開(kāi)始，果實(shí)色澤逐漸去綠變?yōu)槌墒鞎r(shí)暗土黃色。36DAF時(shí)每粒果重為6.8～11.5 mg，成熟種子棕褐色、呈卵圓形。自然成熟時(shí)，種子百粒重為97～113 mg，是擬南芥種子百粒重的48倍多(圖2)。

亞麻薺種子的發(fā)育早期先進(jìn)行伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，然后開(kāi)始加寬橫向生長(zhǎng)。在16DAF時(shí)，種子長(zhǎng)寬比基本固定。在4 DAF到36 DAF的發(fā)育期間內(nèi)，長(zhǎng)度變化范圍是1.13～2.48 mm，寬度變化范圍是0.83～1.49 mm,鮮重變化范圍是0.52～2.37 mg。亞麻薺在16 DAF時(shí)，種子大小和鮮重均達(dá)到最高值(圖3)，且與前期相比，均呈顯著增長(zhǎng)趨勢(shì)，在后期均呈緩慢下降趨勢(shì)。種子在發(fā)育前期呈乳白色，隨著光合作用加強(qiáng)，種子色澤逐漸變綠，到24DAF呈墨綠色。在種子發(fā)育后期，因光合減弱和干燥失水，種子色澤逐漸呈現(xiàn)黃褐色。

圖 1 亞麻薺種子和角果發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes of Camelina sativa fruits and seeds during development注：a、b、c、d、e、f、g、h、i:分別表示開(kāi)花后4、8、12、16、20、24、28、32、36天的種子;A、B、C、D、E、F、G、H、I:分別表示開(kāi)花后4、8、12、16、20、24、28、32、36天的角果.Note:a、b、c、d、e、f、g、h、i: respectively means 4、8、12、16、20、24、28、32、36 DAF seed;A、B、C、D、E、F、G、H、I: respectively means 4、8、12、16、20、24、28、32、36 DAF silique.

圖 2 亞麻薺與擬南芥種子大小比較Fig.2 Seed size comparison between Camelina sativa and Arobidopsis thaliana注：亞麻薺種子百粒重為97～113 mg; 擬南芥種子百粒重為2.1～3.4 mg.Note: Camelina: 97～113 mg per 100seeds; Arabidopsis: 2.1～3.4mg per 100seeds.

圖 3 亞麻薺發(fā)育種子大小和鮮重的變化Fig.3 Changes in size and fresh weight of Camelina sativa seeds during development

2.2 亞麻薺種子發(fā)育過(guò)程中油脂和蛋白積累的動(dòng)態(tài)變化

取不同發(fā)育時(shí)期亞麻薺種子樣品，分別檢測(cè)種子油脂和蛋白積累的動(dòng)態(tài)變化。油脂和蛋白合成積累的速度在不同階段有顯著差異(圖4)。亞麻薺種子發(fā)育早期階段(1～16 DAF)是種子形成期，此階段油脂合成與積累相對(duì)緩慢，蛋白質(zhì)合成積累很快。到種子發(fā)育中期階段(16～24 DAF)，油脂急劇大量合成積累，積累速率約15 μg·d-1。在24 DAF時(shí)，含油量顯著增長(zhǎng)，達(dá)到26.8%(干重)，而每粒含油量可達(dá)到0.47 mg。種子發(fā)育后期階段(24～36 DAF)是成熟脫水期，油脂合成與積累持續(xù)緩慢上升，由于干燥失水，含油量繼續(xù)增加。在16 DAF到36 DAF時(shí)期，蛋白質(zhì)合成積累速度減慢，積累量明顯低于油脂水平。在亞麻薺種子成熟干燥前，水分含量雖逐漸變少卻始終占較大比例，蛋白質(zhì)在種子發(fā)育早期積累相對(duì)較高，在后期發(fā)育過(guò)程中雖仍在不斷積累，但相對(duì)含量增加緩慢。

圖 4 亞麻薺種子發(fā)育過(guò)程中油與蛋白的含量變化Fig.4 Content changes of oil and protein in Camelina sativa seeds during development

2.3 亞麻薺種子發(fā)育過(guò)程中油脂成分的動(dòng)態(tài)變化

在亞麻薺種子發(fā)育至成熟的過(guò)程中，種子油各脂肪酸成分的合成積累也有明顯不同的動(dòng)態(tài)變化(表1)。棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)和花生酸(20∶0)等飽和脂肪酸在種子發(fā)育早期合成積累多，分別為21.7%、 19.5%和3.2%。隨著種子發(fā)育，這3種脂肪酸含量先增長(zhǎng)，然后再逐漸降低為6.9%、2.5%和1.2%。相反，亞麻酸(18∶3)、二十碳烯酸(20∶1)和芥酸(22∶1)的含量從發(fā)育早期的0.3%、0.1%和0 分別持續(xù)增加合成積累高達(dá)41.3%、11.4%和5.6%。油酸(18∶1)和亞油酸(18∶2)的合成積累變化趨勢(shì)表現(xiàn)為前期由低(18.9%和14.6%)到高(25.1%和34.1%)，后期則從峰值逐漸降低(6.1%和14.8%),其中油酸峰值出現(xiàn)在12 DAF，然而亞油酸峰值出現(xiàn)在16 DAF。

脂肪酸成分這種動(dòng)態(tài)變化顯然與參與脂肪酸合成途徑酶蛋白功能的時(shí)序表達(dá)有關(guān)。棕櫚酸、硬脂酸和油酸是在質(zhì)體內(nèi)從頭合成，然后從質(zhì)體轉(zhuǎn)出進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。因此在發(fā)育早期這3種脂肪酸含量高。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，他們?cè)谥舅崦摎涿缸饔孟律砷L(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸(20∶1)多不飽和脂肪酸(18∶2,18∶3)，或在脂肪酸延長(zhǎng)酶催化下碳鏈加長(zhǎng)生成(20∶0)和(22∶1)。這樣在種子發(fā)育后期，棕櫚酸、硬脂酸和花生酸以及油酸含量逐漸降低。然而，其他幾種長(zhǎng)鏈脂肪酸則隨著種子發(fā)育持續(xù)上升。

2.4 亞麻薺不同組織中油脂成分的變化

進(jìn)一步檢測(cè)亞麻薺根、莖和葉等營(yíng)養(yǎng)器官各種脂肪酸含量可為亞麻薺營(yíng)養(yǎng)器官的綜合利用提供依據(jù)。如表2所示，飽和脂肪酸即棕櫚酸、硬脂酸和花生酸在根莖葉器官中含量顯著高于種子中含量，而亞麻酸和二十碳烯酸含量測(cè)明顯低于種子中的水平。其他幾種脂肪酸在營(yíng)養(yǎng)器官和種子中含量差異不大。

表1 亞麻薺種子在不同發(fā)育時(shí)期的脂肪酸組成Table 1 Fatty acid profiles (% wt) of camelina sativa seeds at different development stages

注：數(shù)據(jù)來(lái)自6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn),以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示。16∶0(棕櫚酸),18∶0(硬脂酸),18∶1(油酸),18∶2(亞油酸),18∶3(亞麻酸),20∶0(花生酸),20∶1(二十碳烯酸),22∶1(芥酸),others(其它脂肪酸)。下表同。

Note：Data represent the mean of 6 independent determinations.Values showed by mean ± stand error.16∶0(Palmitic acids),18∶0(Stearic acids),18∶1(Oleic acids),18∶2(Linoleic acids),18∶3(Linolenic acids),20∶0(Arachidic acids),20∶1(Eicosenoic acids),22∶1(Erucic acids),others(Other fatty acids).The same as bellow.

表2 亞麻薺不同器官中脂肪酸的組成Table 2 Fatty acid composition (% wt) of camelina sativa organs

3 討論與結(jié)論

亞麻薺作為一種非糧的新型能源油料作物，產(chǎn)量高達(dá)2 800 kg·hm-2，種子含油量高達(dá)480 g· kg-1，ω-3型脂肪酸即亞麻酸占總油脂的25%～42%。這些特征使得亞麻薺在食品領(lǐng)域,特別是生物能源領(lǐng)域的應(yīng)用受到人們的廣泛關(guān)注。種子產(chǎn)量及種子油脂、蛋白品質(zhì)等農(nóng)藝性狀的穩(wěn)定性對(duì)其在新種植地域推廣極為重要。然而，與其他作物一樣，亞麻薺的籽粒產(chǎn)量，貯藏蛋白質(zhì)和種子油脂、脂肪酸合成積累等性狀又受很多因素的影響，包括品種、氣候、地理位置、生長(zhǎng)階段和土壤環(huán)境，以及大田管理等[9～11]。

山西太谷是亞麻薺新引進(jìn)種植區(qū)域，本文第一次檢測(cè)了在太谷種植區(qū)域自然條件下亞麻薺種子發(fā)育和油脂、蛋白生物合成積累等性狀表達(dá)。試驗(yàn)表明， 所測(cè)性狀的變化處于正常變異范圍之內(nèi)。無(wú)論是春播還是復(fù)播和秋播，亞麻薺均能在該種植區(qū)域正常完成生長(zhǎng)發(fā)育。與Rodríguez等[12]的研究結(jié)果相比，本試驗(yàn)所測(cè)得種子含油量及脂肪酸等數(shù)值比其他所測(cè)相應(yīng)時(shí)期的數(shù)值略高，可能與試驗(yàn)所用品種、當(dāng)?shù)貧夂蚝屯寥罈l件影響有關(guān)。進(jìn)一步分析種子產(chǎn)量高低和種子大小、種子含油量等性狀的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，這與已有報(bào)道基本相似[13]。正是由于這種負(fù)相關(guān)存在，使得同時(shí)提高種子含油量和種子重量(百粒重)的遺傳改良進(jìn)展緩慢，收效不大。

亞麻薺還是一種適于輪作和復(fù)種的環(huán)境友好型油料作物。Chatenet等[14]研究發(fā)現(xiàn)每年3月下旬是亞麻薺高產(chǎn)的最佳播種期。我們從3月到10月每隔半月播種一次，發(fā)現(xiàn)在亞麻薺新引進(jìn)地(山西太谷)6月底7月初播種，能在9月中旬完全成熟和收獲。當(dāng)?shù)匦←溣?月10日前后收割，小麥?zhǔn)斋@后完全可以復(fù)播亞麻薺，從而增加一季作物收獲。值得進(jìn)一步深入研究，以便在當(dāng)?shù)亟⒁环N投資少、見(jiàn)效快、效益高的復(fù)種亞麻薺提高單位面積土地產(chǎn)值的新耕作模式。本文有關(guān)亞麻薺種子發(fā)育及種子油脂積累動(dòng)態(tài)變化的分析，對(duì)亞麻薺新品種的選育、當(dāng)?shù)卦耘喾N植技術(shù)配套，以及工業(yè)應(yīng)用具有科學(xué)參考價(jià)值。

[1]Battey JF,Schmid,KM,Ohlrogge,JB.Genetic engineering for plant oils:potential and limitations [J].Trends Biotechnol,1989,7: 122-126.

[2]Zubr J.Oil seed crop:Camelinasativa[J].Industrial Crops and Products,1997,6:113-119.

[3]Moser,B.R.Biodiesel from alternative oilseed feedstocks: camelina and field pennycress [J].Biofuels,2012,3:193-209.

[4]Chaofu Lu,Jinling Kang.Generation of transgenic plants of a potential oilseed cropCamelinasativabyAgrobacterium-mediated transformation [J].Plant Cell Rep,2008,27:273-278.

[5]Kagale S,Koh C,Nixon J,et al.The emerging biofuel cropCamelinasativaretains a highly undifferentiated hexaploid genome structure [J].Nature Communications,2014,23(5): 3706.

[6]Vollmann J,Damboeck A,Eckl A,et al.Improvement ofCamelinasativa,an under exploited oilseed.In: Janick Jed.Progress in New Crops [M].Alexandria: ASHS Press,1998：357-362.

[7]Dahmer ML,Fleming PD,Collins GB,et al.A rapid screening technique for determining the lipid composition of soybean seeds [J].J Am Oil Chem Soc,1989,66(4): 543-548.

[8]薛金愛(ài),毛雪,吳永美,等.釀酒酵母脂酰-△9脫氫酶亞細(xì)胞定位表達(dá)及其對(duì)煙草脂肪酸合成的影響[J].生物工程學(xué)報(bào),2013(5):630-645.

[9]鄧曙東,張青文.亞麻薺種植和利用的研究現(xiàn)狀[J].植物學(xué)通報(bào),2004,21 (3):376-382.

[10]Josef Z.Oil-seed crop:Camelinasativa[J].Industrial Crops and Products,1997,6(2): 113-119.

[11]Zubr J.Qualitative variation ofCamelinasativaseed from different locations [J].Industrial Crops and Products,2003,17: 161-169.

[12]Manuel Fernando Rodríguez-Rodríguez,Alicia Sánchez-García,Joaquín J.Salas.Characterization of the morphological changes and fatty acid profile of developingCamelinasativaseeds [J].Industrial Crops and Products,2013,50: 673- 679.

[13]Johann Vollmann,Thomas Moritz,Christine Kargl et al.Agronomic evaluation of camelina genotypes selected for seed quality characteristics [J].Industrial Crops and Products,2007,26:270-277.

[14]Chatenet F.Cultivation ofCamelina[J].Oleoscope,1998,48: 27-28.

(編輯：武英耀)

Study on Accumulation of Seed Oil inCamelinasativa,A New Alternative Oilseed Crop

Yuan Lixia1,2,Hao Jingyun1,Zhou Guanghang1,Xue Jin'ai1,Li Runzhi1*

(1.InstituteofMolecularAgricultureandBioenergy,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China;2.CollegeofBiologicalScienceandTechnology,JinzhongUniversity,JinzhongShanxi030600,China)

Camelinasativa(L.) Crtz is a new alternative oilseed crop that produces seeds containing up to 40% oil,among the oil,content of unsaturated fatty acids linoleic and linolenic acid is up to 58%.ω-3 and ω-6 fatty acids (found mainly as linoleic and linolenic acid) are mostly used for food and industrial applications.For comprehensive understanding of Camelina oil synthesis in seed development under the natural environments in Taigu,Shanxi,we characterized the morphological changes,oil content,the fatty acid content and composition of developing Camelina seeds.In the early stages of seed development (1～16DAF,days after flowering),higher levels of palmitic,stearic and oleic acids were formed but total oil lower.During the middle developing period (16～24 DAF),the fatty acid composition progressively changed and produced many kinds of long-chain unsaturated fatty acids,oil content is up to 26.8%,and 0.47 mg each seed at 24 DAF.The final developmental stages (24～36 DAF),at which seed oil content increased due to desiccation.Compared to the vegetable organs including roots,stems and leaves,seed at 36 DAF accumulated much higher levels of linoleic acid (up to 14.8%) and linolenic acid (up to 41.3%).The present data provide some scientific references for Camelia genetic improvement and developing a cultivation system in such newly expanded areas for this important oilseed.

Camelinasativa;Seed development;Seed oil;Fatty acid;Oil accumulation

2015-02-11

2015-04-02

苑麗霞(1979-)，女(漢)，山西武鄉(xiāng)人，博士研究生，研究方向：分子遺傳與基因工程

*通訊作者：李潤(rùn)植，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：0354-6288374； E-mail: rli2001@hotmail com

國(guó)家自然科學(xué)基金(30971806；31201266；31401430),國(guó)家“948”項(xiàng)目(2014-Z39),山西省煤基重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(FT-2014-01)

S565.9

A

1671-8151(2015)03-0271-06