馬振華，張連杰，馬艷琴*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西省環(huán)境獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，山西 太谷 030801)

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人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的建立及優(yōu)化

馬振華1，張連杰2，馬艷琴1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西省環(huán)境獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，山西 太谷 030801)

為優(yōu)化人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)原代及傳代的培養(yǎng)方法，建立一種簡便且能夠獲得數(shù)量較多及活力良好的HUVEC培養(yǎng)體系。分離臍靜脈并插管，用0.1%的II型膠原酶灌注消化分離內(nèi)皮細(xì)胞。M199完全培養(yǎng)基懸浮并接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿80%時，0.25%胰酶-EDTA消化傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞生長情況，姬姆薩染色法鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)，vWF因子相關(guān)抗原免疫熒光法鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。比較不同膠原酶消化時間、不同接種密度、不同胰酶消化時間、不同培養(yǎng)基組分對細(xì)胞得率、形態(tài)和純度的影響。結(jié)果表明，原代培養(yǎng)時，II型膠原酶最佳消化時間為15 min，最佳接種密度為1×106mL-1；傳代培養(yǎng)時，胰酶最佳消化時間為2 min。倒置顯微鏡下觀察和姬姆薩染色結(jié)果顯示，貼壁內(nèi)皮細(xì)胞呈長梭形,且呈單層鋪路石狀排列。免疫熒光檢測結(jié)果表明，細(xì)胞胞漿呈綠色熒光，為vWF因子陽性細(xì)胞，DAPI襯染細(xì)胞核呈藍(lán)色，顯示內(nèi)皮細(xì)胞純度接近100%。本實驗成功建立了HUVEC原代分離培養(yǎng)的優(yōu)化體系，純度高、活力好，為后續(xù)研究做好了準(zhǔn)備。

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞；膠原酶消化法；姬姆薩染色；免疫熒光技術(shù)

血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,EC)是一種多功能細(xì)胞，其在多種疾病中所起的重要作用已越來越受到重視，已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域的重要研究對象[1]。人臍靜脈 (human umbilical vein，HUV)是培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的常用來源之一，與動物血管內(nèi)皮細(xì)胞相比，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (human umbilical vascular endothelial cells,HUVEC)使實驗條件更符合人體情況，結(jié)果更有意義[2]。自1963年起，人們便不斷地開展內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究，以便提供一個接近人體的研究模型。但由于人血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)條件要求高，不易在體外生長，長期以來只能在體外維持培養(yǎng)2～3代。1981年[3]，Maciag的研究使人血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)獲得突破性進(jìn)展，他用從牛下丘腦提取的ECGF作為生長促進(jìn)劑，成功地使人血管內(nèi)皮細(xì)胞在體外連續(xù)培養(yǎng)15～20代。目前，獲取內(nèi)皮細(xì)胞的方法有機(jī)械刮取法、組織貼塊法和酶消化法3種[4,5]。前2種易混雜平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等其它血管壁細(xì)胞，近年已逐漸被酶消化法取代。

本研究采用II型膠原酶灌注法消化分離臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察原代培養(yǎng)時不同的膠原酶消化時間、不同接種密度和傳代培養(yǎng)時不同的胰酶-EDTA消化時間對細(xì)胞得率和細(xì)胞活力狀態(tài)的影響，并對培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，從而改進(jìn)并建立一套操作性強(qiáng)、細(xì)胞獲得多、傳代次數(shù)多的HUVEC培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用新生兒臍帶取自晉中市第二人民醫(yī)院，產(chǎn)婦體健，剖宮產(chǎn)，實驗方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，產(chǎn)婦及家屬均簽署知情同意書。

主要試劑：M199培養(yǎng)基、II型膠原酶、0.25%胰酶-EDTA、胎牛血清、青霉素、鏈霉素(Gibco公司)，明膠(MP公司)，4%多聚甲醛、0.2%TritonX-100、10%山羊血清(Solarbio公司)，兔抗人VIII因子抗體、FITC標(biāo)記山羊抗兔-IgG(博奧森公司)，HEPES、肝素、谷氨酰胺、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)(Sigma公司)。M199完全培養(yǎng)基添加：20%(或10%)胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、6.25 U·mL-1肝素、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素、10 ng·mL-1VEGF。

主要儀器：巴氏吸管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、六孔培養(yǎng)板(Corning公司)，輸液器延長管。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC原代分離培養(yǎng)

將臍帶放置于大平皿中，擠去血液，用巴氏吸管吸棄，剪去血腫多的和有夾痕的臍帶段。臍帶的一端剪斷，暴露出兩條臍動脈和一條臍靜脈(臍動脈壁厚，管腔小，靜脈壁薄，管腔大)。剪輸液延長管適當(dāng)長度，插入臍靜脈3 cm以上，止血鉗固定。從延長管的一端用20 mL注射器吸取PBS沖洗臍靜脈，吸棄洗液。將臍帶轉(zhuǎn)移至新的平皿，結(jié)扎另一端臍帶，注入10 mL左右膠原酶溶液，充盈臍靜脈，止血鉗封閉端口，37℃培養(yǎng)箱孵育。本實驗對孵育時間進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置10、15、20 min3個時間梯度，觀察膠原酶不同處理時間對細(xì)胞得率、純度的影響。期間，輕揉臍帶，以助于細(xì)胞脫落。處理結(jié)束后打開下端，使酶液收集入離心管，PBS沖洗，并收集。1000 r·min-1離心5 min，棄上清，用含20%FBS的M199完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于明膠預(yù)包被的25 cm2培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 原代細(xì)胞不同接種密度的比較

臺盼藍(lán)拒染法進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，設(shè)置1×104、1×105、1×106和1×107mL-14個不同的接種濃度，37℃、5%CO2培養(yǎng)，每2天換液一次，觀察細(xì)胞生長情況及原代培養(yǎng)時間。

1.2.3 HUVEC傳代時胰酶處理時間的比較

吸棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用預(yù)熱的PBS洗2次(以去除殘留的血清)。加入預(yù)熱的胰酶-EDTA溶液，覆蓋細(xì)胞(25 cm2加0.5 mL)，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育。本實驗對孵育時間進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置1、2、3 min 3個時間梯度，觀察不同胰酶消化時間對細(xì)胞脫壁效果及細(xì)胞活力的影響。

處理結(jié)束后加5～7 mL預(yù)熱的含血清M199培養(yǎng)基，以終止胰酶的作用。用巴氏吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞團(tuán)塊分離，1000 r·min-1，離心5 min。傾倒上清，用含10%FBS的M199完全培養(yǎng)基培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.2.4 HUVEC的鑒定

培養(yǎng)的細(xì)胞在相差顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并在6孔培養(yǎng)板制備細(xì)胞爬片，姬姆薩染色法更清晰地呈現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)圖像。采用vWF抗體免疫熒光法鑒定HUVEC細(xì)胞，具體操作如下：從培養(yǎng)板中取出細(xì)胞爬片，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min；0.2%TritonX-100破膜；10%山羊血清室溫封閉30 min；加入兔抗人vWF抗體(1∶100稀釋)，放入濕盒內(nèi)，37℃，60 min；加入FITC標(biāo)記山羊抗兔-IgG，37℃避光孵育60 min；5 μg·mL-1的DAPI室溫襯染細(xì)胞核2 min，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原酶不同消化時間對細(xì)胞純度的影響

研究發(fā)現(xiàn)孵育10 min時，內(nèi)皮細(xì)胞并未完全脫落，細(xì)胞數(shù)量較少；孵育20 min時，不僅內(nèi)皮細(xì)胞脫落，平滑肌細(xì)胞也部分脫落，給后期純化培養(yǎng)造成困難。最佳孵育時間是15 min，此時，內(nèi)皮細(xì)胞消化完全，得率較高且無雜細(xì)胞的污染。HUVEC倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察：細(xì)胞2 h開始貼壁，24 h大部分貼壁，到48 h已完全貼壁。如圖1所示，細(xì)胞呈長梭形生長,且呈單層鋪路石狀排列。姬姆薩染色后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察如圖2所示，細(xì)胞核染成紫紅色或藍(lán)紫色，胞漿染成粉紅色，在光鏡下呈現(xiàn)出清晰的細(xì)胞染色圖像。

vWF抗體免疫熒光法鑒定結(jié)果顯示：熒光顯微鏡下觀察到胞質(zhì)中可見大量綠色熒光，為vWF抗原陽性細(xì)胞，即人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。DAPI襯染所有的胞核均呈藍(lán)色熒光，以PBS緩沖液替代兔抗人vWF抗體的陰性對照無此反應(yīng)。如圖3顯示，所有的細(xì)胞均為HUVEC，純度接近100%。

2.2 不同接種密度細(xì)胞生長狀態(tài)的比較

比較了4個接種密度下原代HUVEC細(xì)胞的生長狀態(tài)及原代培養(yǎng)時間，結(jié)果見表1。1×104mL-1組細(xì)胞分布稀疏，培養(yǎng)10 d以上未達(dá)到匯合，且后期細(xì)胞變大、形態(tài)不規(guī)則，不能傳代； 1×107mL-1組細(xì)胞密度太高，平均1.2 d即達(dá)到匯合需要傳代；1×106mL-1組平均4.1 d能達(dá)到80%匯合，可以傳代，認(rèn)為1×106mL-1是適宜的接種密度。

圖1 倒置顯微鏡下觀察HUVEC呈典型的“鋪路石”形態(tài)(100×)Fig.1 The characteristic “cobblestone” morohology of HUVEC in culture under an inverted microscope(100×)

圖2 HUVEC的吉姆薩染色(100×)Fig.2 Giemsa staining of HUVEC(100×)

圖3 vWF抗體免疫熒光法鑒定HUVEC(100×)Fig.3 Identifying the HUVEC by immunostaining with antibodies against vWF factor(100×)

表1 原代培養(yǎng)不同接種密度下原代培養(yǎng)時間的比較Table 1 Comparing the primary culture time in different planting density

2.3 不同胰酶消化時間對傳代后細(xì)胞數(shù)量及活力的影響

當(dāng)胰酶消化時間為1 min時，細(xì)胞并未全部從培養(yǎng)板底部脫落，傳代后的培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞濃度太低；當(dāng)消化時間為3 min時，胰酶對細(xì)胞的作用時間太長，使細(xì)胞活力降低，導(dǎo)致傳代后的培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長勢不好，且貼壁性差。結(jié)果表明，最佳的消化時間是2 min，此時，培養(yǎng)板上的細(xì)胞幾乎完全脫落，而且傳代后的細(xì)胞能在2 h左右貼壁，長勢良好。所以，本實驗消化時間采用2 min，消化過程中，用顯微鏡檢測細(xì)胞分離的狀態(tài)，也可以輕輕敲打細(xì)胞瓶的側(cè)壁，以促進(jìn)細(xì)胞分離。

3 結(jié)論與討論

3.1 HUVEC分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化

膠原酶灌注消化法分離HUVEC作用溫和，能夠獲得純度較高的內(nèi)皮細(xì)胞，適用于人和多種動物較大血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，故是分離血管內(nèi)皮細(xì)胞的常用方法[6]。本實驗使用輸液器的延長管將膠原酶注入靜脈后，頂端和末端均用止血鉗固定，避免了注射器直接接觸靜脈內(nèi)皮，對內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，從而使得酶消化的方法簡單高效[7]。原代培養(yǎng)時，對膠原酶消化時間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明II型膠原酶的最佳消化時間是15 min。傳代培養(yǎng)時，胰酶-EDTA的最佳消化時間是2 min，而且這一時間也并非固定，取決于胰酶-EDTA的活力(如反復(fù)凍融會降低胰酶活力)。總之，當(dāng)胰酶-EDTA消化細(xì)胞時，應(yīng)在倒置顯微鏡下，密切關(guān)注細(xì)胞的動態(tài)，當(dāng)細(xì)胞大范圍開始流動，即終止消化。

接種密度亦是影響細(xì)胞生長的關(guān)鍵因素。密度過高影響貼壁細(xì)胞的伸展和營養(yǎng)；密度過低，細(xì)胞無法形成生長需要的細(xì)胞社會，生長緩慢造成無法傳代或達(dá)到傳代密度所需的時間過長，造成原代細(xì)胞老化，失去了原有形態(tài)及特性[8]。且不同的細(xì)胞類型適宜的接種密度是不同的，故需要通過實驗摸索。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，1×106mL-1是HUVEC適宜的接種密度。HUVEC屬于難貼壁型的細(xì)胞，體外培養(yǎng)時細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板預(yù)先用2%明膠包被處理會極大改善細(xì)胞的貼壁性能，增加培養(yǎng)細(xì)胞的存活率。

3.2 HUVEC培養(yǎng)基的選擇

血清是動物細(xì)胞培養(yǎng)基的重要組成成分，血清質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響細(xì)胞培養(yǎng)的成功與否[9]。作者對20余次的培養(yǎng)條件進(jìn)行摸索，比較了不同廠家、不同來源的血清對細(xì)胞生長狀態(tài)的影響，結(jié)果表明選擇高質(zhì)量的胎牛血清是HUVEC培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，并在原代培養(yǎng)中使用20%血清含量的M199培養(yǎng)基以利于細(xì)胞的貼壁，24 h后更換為10%血清含量的培養(yǎng)基即能滿足HUVEC生長的需要。內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是維持血管內(nèi)皮細(xì)胞在體外長期培養(yǎng)的必要條件[10]。在實驗中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中加入了VEGF后，細(xì)胞的長勢和貼壁性都比沒添加VEGF時有明顯的改善。文獻(xiàn)顯示，HUVEC培養(yǎng)時肝素鈉的添加可使內(nèi)皮細(xì)胞的純度提高[11]；谷氨酰胺在細(xì)胞生長過程中會消耗，亦需在培養(yǎng)基中補(bǔ)充添加。

本實驗建立的分離培養(yǎng)方法培養(yǎng)的HUVEC原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞經(jīng)倒置顯微鏡觀察、姬姆薩染色形態(tài)觀察及免疫熒光染色技術(shù)鑒定，可以確定培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞且純度高、細(xì)胞貼壁性好，為進(jìn)一步的基礎(chǔ)和臨床研究提供有用的細(xì)胞模型。

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(編輯：馬榮博)

Establishment and Optimizing of the Method of Isolating and Culturing Human Umbilical Vein Endothelial Cells in Vitro

Ma Zhenhua1,Zhang Lianjie2,Ma Yanqin1*

(1.CollegeofLifeScience,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China;2.ShanxiKeyLaboratoryofEnvironmentalVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

Objective To build a simple and efficient culture system which can get more and active human umbilical veins endothelial cells.Methods The newborn umbilical cord was collected and placed in the HBSS collection medium.A cannula was inserted into the vein.Pre-warmed collagenase II was filled into it to isolate the endothelial cells.The cells were collected by centrifugation and resuspended in serum containing culture medium.Then they were transfered to a tissue culture flask and placed in an incubator at 37℃，5% CO2.When a confluent monolayer had formed，the HUVECs were subcultured by 0.25% trypin solution.The cells were observed using an inverted microscope and stained with Giemsa.Then the cells were identified by their positive immunostaining with antibodies against vWF factor.The optimal digestion time of collagenase and trypin was identified.The optimal planting density was analyzed.Result The optimal digestion time of collagenase was 15 min in primary culture and that of the trypin in subculture was 2 min.The optimal planting density was 1×106mL-1The confluent monolayers of HUVEC exhibited the characteristic "cobblestone" morohology in culture under an inverted microscope.Immunofluorescence showed that the cytoplasm presented green fluorescence which was vWF factor positive cell.The nucleus was dyed blue by DAPI.The purity of the cultured endothelial cells was almost 100%.Conclusion We established successfully the optimal system of primary HUVEC culture,which provided high-graded cell models for further research.

Human umbilical vein endothelial cells; Collagenase digestion; Giemsa staining; Immunofluorescence

2014-12-06

2015-01-10

馬振華(1989-)，女(漢)，山西大同人，在讀碩士，研究方向：心血管毒理學(xué)。

*通訊作者：馬艷琴，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。Tel:0354-6286908; E-mail:mayanqin466@163 com

國家自然科學(xué)基金(31302155，31302158);山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動基金(2013YJ39)

Q813.1

A

1671-8151(2015)03-0285-05