趙清，李敏，孫溪，張虎芳*

(1.山西農業(yè)大學 農學院，山西 太谷 030801；2.太原師范學院，山西 太原 030000；3.南開大學 昆蟲學研究所，天津 300071)

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北二星蝽Eysarcoris aeneus的DNA分類學研究(半翅目：蝽科：二星蝽屬)

趙清1，李敏2，孫溪3，張虎芳1*

(1.山西農業(yè)大學 農學院，山西 太谷 030801；2.太原師范學院，山西 太原 030000；3.南開大學 昆蟲學研究所，天津 300071)

本文基于形態(tài)和分子數(shù)據(jù)證明北二星蝽Eysarcorisaeneus和尖角二星蝽E.parvus為同一個種。通過擴增中國二星蝽屬的4個種，尖角二星蝽E.parvus，北二星蝽E.aeneus，二星蝽E.guttigerus和廣二星蝽E.ventralis的線粒體COI基因部分片段(約560 bp)，共獲得28條序列。計算其種間和種內遺傳距離，并基于鄰接法(NJ)、最大似然法(ML)和貝葉斯推斷法(BI)進行系統(tǒng)進化分析；同時，解剖這些種的生殖節(jié)發(fā)現(xiàn)，尖角二星蝽和北二星蝽之間的生殖節(jié)差異遠小于與本屬內其他種間的生殖節(jié)差異，因此，基于遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育分析以及生殖節(jié)形態(tài)差異的結果均顯示北二星蝽和尖角二星蝽之間的差異遠小于這兩個種與屬內其他種之間的差異。我們得出(1)北二星蝽和尖角二星蝽為同一種；(2)DNA分類學可以利用線粒體COI基因解決有爭議的分類學問題，同時綜合利用形態(tài)和分子數(shù)據(jù)能夠為此類問題的解決提供新的方法和視角。

半翅目；蝽科；二星蝽屬；北二星蝽；DNA分類學

二星蝽屬(EysarcorisHahn,1834)隸屬于半翅目Hemiptera異翅亞目Heteroptera蝽科Pentatomidae蝽亞科Pentatominae。二星蝽成蟲、若蟲可通過吸食寄主植物的嫩枝、幼莖或葉片的汁液，致植株生長發(fā)育受阻，籽粒不飽滿，部分種類可危害水稻、麥類、棉花、大豆、胡麻、高粱、甘薯、茄子等作物，是重要的農業(yè)害蟲[1]。據(jù)世界主要產稻國家研究報道，所有為害稻類的昆蟲中，二星蝽屬的廣二星蝽E.ventralis，北二星蝽E.aeneus和E.trimaculatus位居前列[2,3]。本屬昆蟲分布較廣，在蝽科中由于體小，小盾片基角處具黃白色光滑小圓斑而極易鑒定[4]。

其中，北二星蝽E.aeneus和尖角二星蝽E.parvus在形態(tài)上極為相近，唯有前胸背板側角不同(圖1中1～8)，前者側角末端圓鈍且伸出較短，后者末端尖銳呈針狀且伸出較長；生殖器差異較小，僅在陽莖的系膜頂葉、系膜側葉的長短、骨化程度有區(qū)別(圖2 Ie，IIe)；另外，這2種在有些地方為同域分布(表1)。因此該2種的分類地位一直有爭議，Josifov(1978)將此2種合并為北二星蝽E.aeneus，將尖角二星蝽E.parvus做次異名處理[5]，但是未提供詳細的證據(jù)。對于這些形態(tài)特征有變異的分類處理，除了借助外部形態(tài)特征及雄性外生殖器的比較外，還應該提供其他證據(jù)，如分子證據(jù)。

在過去的幾年中，DNA條形碼作為一個分子生物學不可或缺的方法吸引了人們的注意力。它是利用標準化的DNA片段進行物種鑒定的方法[6]，能夠幫助非分類學專家進行物種鑒定。線粒體細胞色素C氧化酶基因COI具有引物通用性高、進化速率快、變異速率在種內相對小，在種間又相對大[6,7]等優(yōu)勢，其5’端648 bp的片段成為動物分類與鑒別的理想DNA 條形碼[8～10]。另外，DNA條形碼在提高物種鑒定效率、發(fā)現(xiàn)新種和隱存種以及研究系統(tǒng)發(fā)育和進化關系等方面提供新的思路和研究工具[11]。因此，DNA條形碼被越來越多地應用于分類，但許多學者建議COI條形碼被用于新種描述或新異名時應與形態(tài)、地理分布等相結合。

本文基于形態(tài)和分子證據(jù)探究北二星蝽和尖角二星蝽兩者的關系。形態(tài)學方面解剖雄性生殖節(jié)并進行比較，分子生物學方面通過擴增線粒體COI基因序列(約560 bp)，計算其種內種間遺傳距離并構建系統(tǒng)進化樹。預期基于兩種數(shù)據(jù)的研究結果推斷(1)北二星蝽和尖角二星蝽是否為同一種；(2)DNA條形碼是否可以有效地解決有爭議的分類學問題。

圖1 北二星蝽、尖角二星蝽、廣二星蝽和二星蝽的成蟲背腹面觀Fig.1 Habitus of E.aeneus,E.parvus,E.ventralis and E.guttigerus,dorsal and ventral view注：1～2.北二星蝽(1.背面觀; 2.腹面觀); 3～4.尖角二星蝽(3.背面觀; 4.腹面觀); 5～6.廣二星蝽(5.背面觀; 6.腹面觀); 7～8.二星蝽(7.背面觀; 8.腹面觀)Note:1～2.E.aeneus (1.dorsal view; 2.ventral view); 3～4.E.parvus (3.dorsal view; 4.ventral view); 5～6.E.ventralis (5.dorsal view; 6.ventral view); 7～8.E.guttigerus (7.dorsal view; 8.ventral view)

1 材料與方法

1.1 形態(tài)學

雄性生殖器取自回軟的標本，將其放入2%的NaOH溶液中并在燈下烤30 min，之后置于清水中數(shù)分鐘使陽莖充分膨脹。觀察時需讓陽莖膨脹充分至完全伸出陽莖鞘之外，必要時可以輔助一些器械。觀察完之后，將生殖器保存于甘油當中，和原標本放在一起。成蟲的背腹面照片采用Nikon SMZ1000照相。所用標本均來自于南開大學昆蟲標本館。

1.2 分子生物學

選取尖角二星蝽16頭、北二星蝽8頭、廣二星蝽和二星蝽各2頭，試驗中所得數(shù)據(jù)均來自于酒精浸制標本提取(標本詳細信息見表1)。

基因組的提取采用試劑盒(康為世紀CW0546)。證據(jù)標本除胸部肌肉用于提取基因外，其他部分酒精保存，存放于南開大學昆蟲所。PCR擴增采用如下引物:YT1F(5-AAACTATTAACCTTCAAAG-3)/HCO2198(5-GTCGTGGAAGAAGATTAGTTGTTCTAT-3)。

圖2 北二星蝽、尖角二星蝽、廣二星蝽和二星蝽的雄性生殖節(jié)圖Fig.2 Male genitalia of E.aeneus,E.parvus,E.ventralis and E.guttigerus注：I: 北二星蝽; II: 尖角二星蝽; III: 廣二星蝽; IV: 二星蝽; a: 生殖囊背面觀; b: 生殖囊腹面觀; c:陽基側突端面觀; d: 陽基側突側面觀; e: 陽莖Note:I: E.aeneus; II: E.parvus; III: E.ventralis; IV: E.guttigerus; a: dorsal view of pygophore; b: ventral view of pygophore; c: apical view of paramere; d: lateral view of paramere; e: aedeagus

PCR擴增的反應體積為50 μL，2 μL上游和下游引物，2～5 μL的基因組模板，25 μL的Mix預混液(康為世紀CW0556)，加ddH2O補足至50 μL。PCR反應為92 ℃變性40 s，45 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min共5個循環(huán)，之后再92 ℃變性40 s，51 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共33個循環(huán)，反應前94 ℃預變性2 min，反應后72 ℃再延伸8 min，最后4 ℃保溫。

經PCR擴增后，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，若條帶整齊明亮，將PCR產物送至金維智測序公司直接測序。

獲得數(shù)據(jù)后，使用BioEdit7.0[12]打開峰圖文件，檢查序列的單一性，對得到的每條序列進行校對、拼接，并結合峰圖進行修正，確定準確無誤后將其另存為Fasta格式文件；然后導入Mega 6.0[13]軟件中，用無脊椎動物線粒體遺傳密碼子表對COI基因進行翻譯，適當調整閱讀框檢查有無終止密碼子存在，以排除假基因的干擾。將所得序列在NCBI上進行BLAST搜索，得到的同源序列大多數(shù)為蝽科線粒體基因組的COI片段。在BioEdit中，用ClastalW進行比對，去掉兩端不整齊的序列。用DAMBE4.0.36[14]計算單倍型個數(shù)，不同的單倍型用于遺傳距離的計算和系統(tǒng)進化樹的分析。用Mega6.0基于Kimura-2-Parameter[15]計算種間和種內遺傳距離。

系統(tǒng)進化樹基于鄰接法(NJ)[16]，最大似然法(ML)和貝葉斯推斷法(BI)構建。最大似然法和鄰接法由PAUP* 4.10b10[17]windows版本執(zhí)行。貝葉斯法由MrBayes 3.1[18]運算，最適合數(shù)據(jù)集的進化模型利用Modeltest 3.7[19]測得采用GTR+I模型，運行1 000 000代，每1 000代抽樣一次，“burn in”25%的樣本后構建系統(tǒng)進化樹。所構建的進化樹均采用TreeView1.6.6查看編輯。

表1 實驗所用標本的詳細信息

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學數(shù)據(jù)

北二星蝽Eysarcorisaeneus(Scopoli,1763)(圖1)

CimexaeneusScopoli,1763: 122.

CimexfucatusRossi,1790: 235.

CimexperlatusFabricius,1794: 125.

Eysarcorisperlatusvar.spinicollisPuton,1881: 76; 1881: 56

Eysarcorisperlatusvar.ventralisHorvath,1882: 219.

EysarcorisparvusUhler,1896: 258.

Eysarcorisaeneusvar.peeziTamanini,1961: 122.

Eysarcorisaeneusf.nigriventrisStichel,1962: 781.

鑒別特征：頭側葉稍長于中葉，具銅綠色金屬光澤。胝區(qū)具一黑斑，方形。前胸背板側角略伸出，或呈尖刺狀伸出。小盾片倒三角形，基角各具一長橢圓形的斜置黃白斑，末端外緣常具3個小黑斑。腹部腹面中央均勻漆黑，邊緣呈鋸齒狀，兩側各具一長短不等的黑縱紋。

形態(tài)特征：體卵圓形，淡黃褐色，密被黑色粗刻點。

頭：黑色，具銅綠色光澤，端部略下傾，基部中央具淺色短縱紋；側葉末端圓鈍，稍長于中葉；復眼褐色，單眼紅色；觸角黃褐色，第IV節(jié)端部及第V節(jié)黑。頭部腹面黑，具銅綠色金屬光澤；喙黃褐色，末端伸達后足基節(jié)處。

胸：前胸背板寬大于長，前半略下傾，后半隆拱；胝區(qū)具一近方形黑斑；側角末端圓鈍，略伸出，部分個體側角呈尖刺狀伸出較長。小盾片倒三角形，基角具一斜列的長橢圓形黃白斑；末端圓鈍，不超過前翅革片末端，邊緣常具3個小黑點斑。各胸部側板黃褐色，具黑色粗刻點；臭腺溝緣呈耳狀，超過后胸側板一半。足淡黃褐色，腿節(jié)亞端部具一小黑斑。

腹：腹部腹面淡黃褐色，基部中央無前指的突起；中央具黑色縱帶，約占腹部1/3，邊緣鋸齒狀，其兩側各具一長短不等的黑縱紋。氣門黑色。

雄蟲生殖節(jié)(圖2)：生殖囊杯狀，寬大于長，腹后緣中央呈寬“V”狀內凹，兩側呈脊狀加厚，略向腹面翻卷(圖2 Ia，IIa,Ib，IIb)。陽基側突較細長，末端指狀(圖2 Id，IId)。陽莖端較短，向端部漸細；系膜頂葉深二叉狀，內側骨化；系膜側葉亦分叉，部分骨化(圖2 Ie，IIe)。

此種的前胸背板側角變異較大：部分個體側角末端圓鈍，伸出體外較短；部分個體側角末端呈尖刺狀，水平伸出較長。解剖其雄性生殖節(jié)發(fā)現(xiàn)這兩類個體的生殖節(jié)差異與其他種比起來差異小很多，如生殖囊背腹后緣的彎曲程度(圖2：Ia，Ib，IIa，IIb)，陽莖端的長短、系膜頂葉的形狀及的長短、系膜側葉的骨化程度及長短(圖2：Ie，IIe)等在種間差異很大，而在這兩類個體之間變化相對小。

2.2 分子數(shù)據(jù)

2.2.1 遺傳距離分析結果

經測序共獲得28條序列，用DAMBE統(tǒng)計得出有17個單倍型，其中尖角二星蝽16條序列10個單倍型，北二星蝽8條序列7個單倍型，而北二星蝽和尖角二星蝽的部分序列出現(xiàn)共享單倍型“HAP9”“HAP15”。利用MEGA6.0分析COI序列(558bp)中共有保守位點(Conserved)453個，變異位點(Variable)105個，簡約信息位點(Parsim-info)101個，單突變子(Singleton)4個。統(tǒng)計堿基組成顯示，密碼子第一位T、C、A、G平均含量分別為40%、8.2%、48.3%、3.5%，密碼子第二位T、C、A、G平均含量分別為25%、17.5%、30.7%、26.9%，密碼子第三位T、C、A、G平均含量分別為45%、25.6%、13.4%、16.2%，而G+C平均含量為33.6%，遠低于A+T的含量，符合線粒體基因的高A-T含量的特性。

利用MEGA6.0對COI基因基于K-2-P計算種內/種間遺傳距離(表2)。由表2可以看出廣二星蝽與北二星蝽、尖角二星蝽、二星蝽的遺傳距離分別為0.163 7、0.165 8、0.110 2，而尖角二星蝽和北二星蝽的種間遺傳距離為0.0119。根據(jù)Hebertetal.(2004)提出的標準，種間遺傳距離應大于種內距離的10倍，所以尖角二星蝽和北二星蝽應該為同一個種。

表2 基于COI基因種內-種間遺傳距離Table 2 The intra-and inter-species genetic distance(K2P)of COI

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

我們選取本屬的廣二星蝽E.ventralis作為外群，系統(tǒng)進化樹的結果顯示，基于NJ、ML和BI構建的系統(tǒng)進化樹結果基本一致，且節(jié)點支持率較高(圖3～圖5)。在各進化樹中二星蝽E.guttigerus及早的分出，北二星蝽和尖角二星蝽聚為一大支，且節(jié)點支持率均較高，為100或1.00，雖支系內部略有差異，但總體來說無論是基于哪種算法的系統(tǒng)進化結果均不支持二星蝽和尖角二星蝽的單系性。

圖3 基于COI基因構建的Bayesian系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Bayesianbased on COI gene

圖4 基于COI基因構建的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of NJ based on COI gene

圖5 基于COI基因構建的ML系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of ML based on COI gene

3 結論與討論

Josifov(1978)雖然將北二星蝽和尖角二星蝽合并為一個種，但是文中未提供詳細證據(jù)，亦未提供雄性外生殖節(jié)圖。本文通過解剖北二星蝽與尖角二星蝽的雄性生殖節(jié)，詳細比較兩種生殖節(jié)各部分結構，并與廣二星蝽及二星蝽的雄性生殖節(jié)結構進行比較，結果顯示尖角二星蝽和北二星蝽的形態(tài)差異與同屬其他種相比差異極小，不足以達到種的界限。同時擴增了二星蝽屬內4個種的COI基因，計算其種內種間遺傳距離，結果顯示北二星蝽與尖角二星蝽間的種間遺傳距離為0.0119，與本屬內的種內遺傳距離相似，且與其他種的種間遺傳距離在0.139 1～0.165 8之間，如此大的差距，給予Josifov(1978)提出的次異名處理提供了強有力的證據(jù)支持。另外，基于三種算法構建的系統(tǒng)進化樹結果均不支持兩者的單系性。因此，無論從形態(tài)數(shù)據(jù)還是分子數(shù)據(jù)我們均能證明尖角二星蝽和北二星蝽為同一種。

同時，該研究也證明，DNA分類學能夠為傳統(tǒng)分類學服務。當遇到形態(tài)數(shù)據(jù)與分子數(shù)據(jù)有異議時，我們需要重新審視鑒定結果，還應該結合生態(tài)學、地理分布等來共同分析其物種界限。毫無疑問，DNA 條形碼可以幫助一些毫無頭緒的屬種縮小鑒定范圍；同時，傳統(tǒng)分類學又能從形態(tài)上對分子結果進行檢測。在研究過程中，我們必須將兩種方法相互補充、完美結合才能最大限度發(fā)揮DNA分類學的優(yōu)勢。

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(編輯：武英耀)

Study on DNA Taxonomy ofEysarcorisaeneus(Hemiptera: Pentatomidae:Eysarcoris)

Zhao Qing1,Li Min2,Sun Xi3,Zhang Hufang1*

(1.CollegeofAgronomy,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China;2.TaiyuanNormalUniversity,TaiyuanShanxi030000,China;3.CollegeofLifeSciences,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)

This paper based on morphology and molecular data to prove thatEysarcorisaeneus andEysarcorisparvusare the same species.We performed on 28 specimens,amplified about 560bp segment of the mitochondrial cytochrome coxidase I gene (COI) of 4 species,E.parvus,E.aeneus,E.guttigerusandE.ventralis.Computed the inter- and intra-species genetic distances and constructed the phylogenetic trees based on NJ,ML and BI methods.At the same time,we dissected the male genitalia of these species,compared their differences.All the results of the genetic distances,phylogenetic analysis and genitalia morphological characters showed that the difference and the genetic distance betweenE.aeneusandE.parvusmuch less than the difference amongE.aeneus,E.ventralisandE.guttigerus.So we concluded (1)E.aeneusandE.parvusare the same species; (2) DNA barcoding can resolve the argued taxonomy problems using the partial segment of mitochondrialCOIgene.The fact that based on molecular and morphological data can provide the new ideas and new perspective to resolve the taxonomy.

Heteroptera;Pentatomidae;Eysarcoris;Eysarcorisaeneus;DNA taxonomy

22015-03-10

2015-04-04

趙清(1985-)，女(漢)，山東臨沂人，講師，博士后，研究方向：DNA分類學

*通訊作者：張虎芳，教授，碩士生導師；Tel: 0354-6288225；E-mail: zh_hufang@sohu com

國家自然科學基金(31440078);山西省教育廳高等學?？萍紕?chuàng)新基金(2014131);山西農業(yè)大學科技創(chuàng)新基金(2014017)

S433.3

A

1671-8151(2015)03-0241-08