梅梅等

[摘要] 目的 探討白藜蘆醇對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠MMP-9及TIMP-1的影響。 方法 選擇健康7日齡新生Wistar大鼠 112只，分為三組：假手術(shù)組（n=36只）、缺氧組（n=38只）、HIBD+白藜蘆醇藥物干預(yù)組（n=38只），各組再分為6 h、24 h、48 h、72 h、5 d和7 d時(shí)間段進(jìn)行檢測。比較各組不同時(shí)間點(diǎn) MMP-9、TIMP-1的表達(dá)。 結(jié)果HIBD組的MMP-9水平治療6 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d分別顯著高于假手術(shù)組，但經(jīng)RES干預(yù)后，HIBD+RES組的MMP-9水平分別顯著低于HIBD組（P<0.05），但仍顯著高于假手術(shù)組。 結(jié)論 RES能夠抑制MMP-9的表達(dá)，從而使伴隨MMP-9病理性表達(dá)升高的TIMP-1也相應(yīng)減少，而調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1的平衡，可能是其在HIBD中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 缺氧缺血性腦損傷；新生大鼠；白藜蘆醇；MMP-9；TIMP-1

[中圖分類號(hào)] R722.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）09-0006-02

The impact of resveratrol on MMP-9 and TIMP-1 for hypoxic ischemic brain damage in neonatal rats

MEI Mei1 WANG Xianhe1 SUN Huawei2

1.Department of Pediatric，the First Affiliated Hospital of Jiamusi University， Jiamusi 154002，China； 2.Department of Radiotherapy，the First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China

[Abstract] Objective To investigate the impact of resveratrol on MMP-9 and TIMP-1 for hypoxic ischemic brain damage in neonatal rats. Methods Selected healthy 7 day old newborn Wistar rats 112 rats，were divided into three groups： sham operation group （n=36）， hypoxia group （n=38 only）， HIBD+resveratrol drug intervention group （n=38）， each group was tested at 6 h， 24 h， 48 h， 72 h， 5 d and 7 d. The expression of TIMP-1 and MMP-9 Groups were compared at different time points. Results The MMP-9 level of 6 h， 24 h， 48 h，72 h， 5 d， 7 d in HIBD group， were significantly higher than those in the sham operation group，and was significantly higher than that of RES， but the MMP-9 levels in intervention group HIBD+RES were significantly lower than those in HIBD group（P<0.05）， but still significantly higher than those in the shamoperation group. Conclusion The expression of RES can inhibit MMP-9， so with MMP-9 diseaseand rational expression of elevated TIMP-1 also reduce， and regulate the balance of MMP-9/TIMP-1， may be the one of the nerve protection mechanism in HIBD.

[Key words] Hypoxic ischemic brain damage； Neonatal rat； Resveratrol； MMP-9； TIMP-1

新生兒缺氧缺血性腦損傷（HIBD）是導(dǎo)致小兒智能低下和腦性癱瘓的重要原因。腦水腫是其最常見的病理改變，包括早期細(xì)胞毒性水腫和血腦屏障（BBB）損傷引起的血管源性腦水腫（VBE）。近年來研究證實(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）與急性期BBB的損傷密切相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致VBE的形成，而MMP-9的活性又受其金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP-1）的特異性抑制[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，通過藥物抑制MMP-9在HIBD中的表達(dá)以減輕腦水腫，可能為治療缺氧缺血性腦病拓展新思路。白藜蘆醇（resveratrol，RES）是來源于植物中的一種脂溶性天然植物抗毒素，研究證實(shí)，其具有抗血小板聚集、抗炎、清除自由基、抗癌、抗氧化、心血管保護(hù)等作用[2，3]。本研究旨在探討白藜蘆醇對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠MMP-9及TIMP-1的影響，從而為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制研究提供進(jìn)一步的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

健康7日齡新生Wistar大鼠 112只，購于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。納入標(biāo)準(zhǔn)：精神活潑，反應(yīng)靈敏，體形正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：未達(dá)到上述年齡標(biāo)準(zhǔn)；精神萎靡，反應(yīng)遲鈍；有感染及其他不健康癥狀；行走不穩(wěn)。將112只Wistar大鼠分為三組：假手術(shù)組（n=36只）：手術(shù)分離頸總動(dòng)脈后不結(jié)扎，縫合手術(shù)切口后，不放入氧倉做低氧處理；缺氧組（n=38只）：單純做缺氧缺血性腦病（HIBD）模型；HIBD+白藜蘆醇藥物干預(yù)組（n=38只）：HIBD模型制作后每天腹腔注射2%的RES藥液，按50 μg/g，1次/d。各組分為6 h、24 h、48 h、72 h、5 d和7 d 個(gè)時(shí)間段進(jìn)行檢測。

1.2方法

1.2.1 建立HIE動(dòng)物模型 取新生7日齡Wistar大鼠。取頸正中1 cm左右縱形切口，在左側(cè)胸鎖乳突肌深面與氣管之間找到并游離左側(cè)頸總動(dòng)脈，暴露左頸總動(dòng)脈，用5-0號(hào)絲線結(jié)扎雙線結(jié)扎后剪斷左側(cè)頸總動(dòng)脈。以（1～2）L/min的速度，持續(xù)輸入含8%氧氣和92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w，以CY-12C測氧儀監(jiān)控氧濃度為（8±0.5）%，低氧2 h后將新生鼠取出，返回母鼠身邊繼續(xù)喂哺以備用。同時(shí)假手術(shù)組（僅做頸正中切口，游離左側(cè)頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎）亦不做低氧處理。

1.2.2 藥物配制及干預(yù)治療 無菌操作下先用醫(yī)用酒精溶解RES，再用生理鹽水稀釋濃度為2%的溶液，-20℃冰箱保存。造模成功后藥物干預(yù)組乳鼠按50 μg/g，腹腔注射給藥，1次/d。缺氧組乳鼠則同時(shí)給予上述標(biāo)準(zhǔn)等量生理鹽水腹腔注射。至各不同時(shí)間點(diǎn)處死取材。

1.2.3 取材及切片的制作 三組大鼠分別于缺氧缺血后6 h、12 h、24 h、72 h、5 d和7 d處死。斷頭取腦，以視交叉為切點(diǎn)，冠狀位向后取一片約厚3 mm組織。標(biāo)本按常規(guī)給予甲醛固定。用石蠟切片機(jī)做連續(xù)冠狀切片，置于經(jīng)多聚-L-賴氨酸處理的防脫載玻片上，片厚5 μm。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測MMP-9、TIMP-1的表達(dá) 選用SP即用型免疫組化試劑盒進(jìn)行免疫染色，DAB顯色。所有步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。設(shè)置對照：取相同量的PBS代替一抗MMP-9和TIMP-l，其余步驟同前。

1.3 陽性細(xì)胞的判斷[4]

MMP-9、TIMP-1陽性著色表現(xiàn)為胞漿染成淺黃色棕黃色或棕褐色。采用陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)法，每張切片在400倍物鏡下分別隨機(jī)選取不重復(fù)的6個(gè)視野，計(jì)數(shù)MMP-9、TIMP-1陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較使用t檢驗(yàn)或進(jìn)行方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

見表1、2。HIBD組的MMP-9水平、TIMP-1水平治療6 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d分別顯著高于假手術(shù)組，但經(jīng)RES干預(yù)后，HIBD+RES組的MMP-9水平顯著低于HIBD組（P<0.05），但仍顯著高于假手術(shù)組。

3討論

MMPs是降解ECM、同時(shí)又是阻止ECM對血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)作用的主要蛋白酶，參與胚胎正常發(fā)育及組織重塑，并在多種病理過程中發(fā)揮作用[5]。近研究表明，腦缺氧缺血后出現(xiàn)MMP-9的合成上調(diào)，MMP-9與BBB的破壞、繼發(fā)性炎性反應(yīng)和VBE等密切相關(guān)[6]。研究顯示[7]在局灶性腦缺血再灌注小白鼠模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，活化的MMP-9的早期出現(xiàn)導(dǎo)致BBB破壞和VBE。而MMPs的表達(dá)可經(jīng)多種機(jī)制調(diào)控發(fā)生：轉(zhuǎn)錄水平、酶原激活水平和TIMPs的調(diào)節(jié)。

TIMP-1由巨嗜細(xì)胞、角質(zhì)生產(chǎn)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞合成，能抑制絕大多數(shù)MMPs，己經(jīng)證實(shí)TIMP-1優(yōu)先與MMP-9特異性結(jié)合，形成可溶性非共價(jià)復(fù)合物而發(fā)揮其抑制作用[8]。且研究發(fā)現(xiàn)，TIMPs不僅是MMPs的抑制劑，可能還在MMPs的激活級聯(lián)過程中扮演重要角色[9]。

國內(nèi)對于MMP-9、TIMP-1在參與缺血性腦血管病變后BBB損害、VBE的形成過程中的變化規(guī)律及相互關(guān)系研究甚少；對于MMP-9在腦缺血再灌注損傷過程中其非特異性抑制劑干預(yù)方面的研究文獻(xiàn)也很少見。

RES是一種發(fā)現(xiàn)于多種食用植物和紅葡萄酒的天然化合物，具有抗氧化活性、抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、雌激素樣活性、生長抑制活性、免疫調(diào)節(jié)以及化學(xué)預(yù)防作用、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抗腫瘤活性等[10]。近年針對RES神經(jīng)保護(hù)性作用的研究也成為近年來神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域里的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HIBD組的MMP-9水平治療6 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d分別顯著高于假手術(shù)組，但經(jīng)RES干預(yù)后，HIBD+RES組的MMP-9水平分別顯著低于HIBD組（P<0.05），但仍顯著高于假手術(shù)組，證實(shí)RES不但可抑制MMP-9的表達(dá)，并使與其伴隨升高的TIMP-1的表達(dá)也相應(yīng)減少，尤其是在VBE發(fā)生的高峰時(shí)期24～48 h間，RES可明顯減少M(fèi)MP-9的表達(dá)，從而降低了TIMP-1的病理性表達(dá)增強(qiáng)的反應(yīng)，而調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1的平衡，從而減輕腦水腫發(fā)揮腦保護(hù)的作用[11]。

綜上，我們得出，RES能夠抑制MMP-9的表達(dá)，從而使伴隨MMP-9病理性表達(dá)升高的TIMP-1也相應(yīng)減少，而調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1的平衡，可能是其在HIBD中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。

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（收稿日期：2015-02-02）