秦世鵬第

[摘要] 目的 探討JNK與Smad途徑介導小鼠肺纖維化中Ⅰ型膠原的表達及二者相互作用的研究。 方法 選擇雄性野生健康C57BL/6小鼠96只，隨機分為正常組（N組）、模型組（M組）、p-Smad3阻斷組（SB組）、JNK阻斷組（SP組），每組24只。M組、SB組及SP組氣管內滴注博萊霉素3.5 mg/kg誘導肺纖維化模型，于造模后給予相應藥物，N組給予等劑量生理鹽水。每組分別于造模后第7、14、28天隨機處死8只小鼠，取肺組織病理切片行HE染色和Masson染色，觀察肺泡炎和纖維化程度；堿水解法檢測肺組織羥脯氨酸（Hyp）含量；免疫組化法測定肺組織Ι型膠原、p-JNK及p-Smad蛋白含量，各組進行對比。 結果 M組第7天肺泡炎癥明顯，第28天纖維化改變顯著；隨著時間推移，羥脯氨酸含量呈逐漸上升趨勢，第28天含量最高。SB組、SP組與M組比較，肺泡炎癥及纖維化程度均有所減輕；第14、28天Hyp含量稍降低，Ⅰ型膠原、p-JNK及p-Smad蛋白的表達有所減少（P<0.05）。結論 肺纖維化與JNK及Smad通路關系密切，JNK與Smad信號通路在TGF-β1誘導的ECM過度聚集發(fā)揮重要作用；JNK的活化會增加Smad3蛋白的磷酸化，而Smad途徑的激活也會加強JNK的活化，兩條通路的相互關聯(lián)將為進一步治療肺纖維化提供新思路。

[關鍵詞] 肺纖維化；轉化生長因子β1；JNK信號通路；Smad信號通路；Ⅰ型膠原

[中圖分類號] R563.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）09-0001-05

Study of JNK and Smad signal pathways interaction in pulmonary fibrosis in mice and the influence on the expression of type I collagen

QIN Shipeng1 LIU Xuejun2 WANG Xiaohui2 ZHONG Jianke2 DU Yufeng2

1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China；2.Department of Geriatrics，the First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of type Ι collagen in JNK and Smad mediated pulmonary fibrosis of mice and study the interactions between the two mediation. Methods Ninety-six healthy wild male C57BL/6 mice were randomLy divided into four groups，the normal group（N group，n=24），the model group（M group，n=24），the p-Smad3 blocking group（SB group， n=24） and the JNK blocker group（SP group，n=24）. M group，SB group and SP group were endo-tracheal driped by bleomycin（3.5 mg/kg） to estabish pulmonary fibrosis model and then given corres-ponding drugs， while the N group was given isodose physiological saline. Eight mice in each group were randomly killed on the 7th，14th，28th. The degree of alveolitis and pulmonary fibrosis by the mice lung tissue pathological in HE staining and Masson staining were observed，lung tissue hydroxyproline（Hyp） content by alkaline hydrolysis method were and dected each groups lung tissue of type I collagen，p-JNK and p-Smad protein content by immunohistochemical determination were compared. Results The degree of pulmonary alveolitis of M group was obvious on the 7th day after modeling and the fibrosis was reduced significantly on the 28th day. The Hyp increased gradually and reached the maximum level on the 28th day. The pulmonary alveolitis and fibrosis of lung tissue in SB，SP and N group were in a relatively low degree，compared with M group. The Hyp ration of these groups were on a slightly lower level；the expression of type I collage，p-JNK and p-Smad protein were reduced（P<0.05）. Conclusion Pulmonary fibrosis are closely associated with JNK and Smad pathway，JNK and Smad signaling pathway play an important role in TGF-β1 induced excessive accumulation of ECM.The activation of JNK may increase the phosphorylation of Smad3 protein， and the activation of Smad pathway can also be activated to strengthen JNK.This two interrelated pathways will provide new ideas for the step in the treatment of pulmonary fibrosis.

[Key words] Pulmonary fibrosis；Transforming growth factor β1；JNK signaling pathway；Smad signaling pathway；Type Ι collagen

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種早期以肺泡炎癥，后期以大量成纖維細胞（fibroblast，F(xiàn)B）異常增殖和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）大量沉積為主要表現(xiàn)特點的肺間質疾病[1]。轉化生長因子β1（TGF-β1）是重要的致纖維化因子，通過多個信號通路發(fā)揮作用，JNK及Smad信號通路是其下游的重要信號通路，p-Smad3高表達與炎癥纖維化的發(fā)展密切相關[2]。Ⅰ型膠原是ECM中反映肺纖維化程度的主要指標，本研究主要使用特異性阻滯劑阻斷Smad及JNK信號通路后，觀察Ⅰ型膠原的變化程度以及兩條通路的相互關聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選取18～20 g雄性野生C57BL/6小鼠96只，2014年1月購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，于山西醫(yī)科大學動物實驗中心飼養(yǎng)，SPF級。博萊霉素（日本化藥株式會社），SP600125、SB431542及二甲基亞砜（DMSO）溶液（美國sigma公司）；Masson染液試劑盒、羥脯氨酸試劑盒（南京建成生物工程研究所）；兔抗鼠p-JNK、p-Smad3及Ⅰ型膠原多克隆抗體（美國Bioworld公司）；SABC試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑（武漢博士德公司）。

1.2 模型分組及處理

選擇雄性野生健康C57BL/6小鼠96只，隨機分為正常組（N組）、模型組（M組）、p-Smad3阻斷組（SB組）和JNK阻斷組（SP組），每組24只。N組給予氣管內滴注0.9%氯化鈉注射液0.04 mL，其余三組氣管內滴注博來霉素0.04 mL（3.5 mg/kg）建立肺纖維化模型。SP組采用SP600125溶于二甲基亞砜（DMSO）溶液，腹腔注射0.03 mL（15 mg/kg），于造模當日注射；其余各組腹腔注射相同劑量的二甲基亞砜（DMSO）溶液；SB組于造模后第3、4、5天腹腔內注射SB431542（按4.2 mg/kg，0.5 mL/只，溶于10%乙醇），其余三組給予等體積10%乙醇。

1.3 組織指標測定

每組分別于造模后第7、14、28天隨機處死8只小鼠，取肺組織病理切片行HE染色和Masson染色，觀察肺泡炎和纖維化程度；堿水解法檢測肺組織羥脯氨酸（HYP）含量；免疫組化法測定肺組織Ι型膠原、p-Smad3及p-JNK蛋白含量，各組進行對比。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學改變

N組各時間點肺泡壁完整，肺泡腔大小均勻且無明顯滲出，偶可見少量炎細胞或成纖維細胞，支氣管壁完整（圖1）；M組小鼠第7天出現(xiàn)明顯的肺泡炎，肺泡間隔增寬，肺泡間隔及肺泡腔內單核巨噬細胞增生，可見少量成纖維細胞增生，病灶內見肺泡萎縮，Masson染色藍染的膠原纖維表達量少（圖2）；第14天炎癥稍減輕，仍見少量炎癥細胞的浸潤，包括少量中性粒細胞、單核巨噬細胞和淋巴細胞，可見成纖維細胞增多，肺泡間隔顯著增厚、增寬，肺泡壁、支氣管壁增厚，部分肺泡萎縮、閉合，Masson染色見藍染的膠原纖維表達量增多（圖3）；第28天肺泡炎癥程度明顯減輕，肺泡結構破壞嚴重，肺間質內見成纖維細胞大量增生，纖維化程度加重，Masson染色見藍染的膠原纖維表達增多（圖4）。SB組、SP組鏡下觀察，各時間點炎癥反應及纖維化程度均較M組減輕（圖5～19）。

2.2肺組織羥脯氨酸含量的測定

N組羥脯氨酸有少量表達，其他各組羥脯氨酸的表達均隨時間延長而增加，第28天達高峰。第7天各組Hyp含量比較，差異有統(tǒng)計學意義，第14、28天M組、SB組、SP組較N組表達明顯增多，SB組、SP組較M組表達明顯減少，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 肺組織羥脯氨酸含量（x±s，μg/mg，n=8）

注：與N組比較，aP<0.05；與M組比較，bP<0.05

2.3 肺組織p-JNK蛋白免疫組織化學結果

N組偶有少量陽性表達，主要見于肺泡上皮細胞及小氣道上皮細胞；M組主要見于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、血管內皮細胞、小氣道上皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞及浸潤炎癥細胞的胞漿、胞核，各時間點灰度值均較N組顯著降低，即p-JNK蛋白表達均較N組顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；M組表達從第7天開始升高、第14天達高峰、第28天開始下降；SB組、SP組與M組變化趨勢基本相同，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 肺組織p-JNK蛋白灰度值（x±s）

注：與N組比較，aP<0.05；與M組比較，bP<0.05

2.4肺組織p-Smad蛋白免疫組織化學結果

N組偶有少量陽性表達，多見于肺泡上皮細胞及小氣道上皮細胞；M組多見于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、小氣道上皮細胞、平滑肌細胞、血管內皮細胞，巨噬細胞及浸潤炎癥細胞的胞質、胞核陽性表達增多；各時間點p-Smad蛋白灰度值均較N組顯著降低，即p-Smad蛋白表達均較N組顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；M組表達從第7天開始升高、第28天達高峰；SB組、SP組與M組變化趨勢基本相同，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 肺組織p-Smad蛋白灰度值（x±s）

注：與N組比較，aP<0.05；與M組比較，bP<0.05

2.5 肺組織Ⅰ型膠原免疫組織化學結果

N組各時間點呈弱陽性反應，主要分布于支氣管周圍、血管周圍及肺泡間隔處，灰度值最大（注：灰度值越大說明蛋白表達越少），即N組有少量I型膠原蛋白表達；其他三組第7天表達較N組分布明顯增加，但差異無統(tǒng)計學意義。第14、28天時在M組肺內分布迅速增加，呈條索狀、斑片狀分布，于肺泡間隔處增加最顯著，各時間點灰度值均較N組顯著降低，即M組各時間點I型膠原含量較N組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；M組表達從第7天開始升高、第28天達高峰；SB組、SP組與M組變化趨勢基本相同，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種原因不明的慢性間質性肺疾病，以成纖維細胞增生和ECM過度分泌為主要病理特征，ECM分泌大量膠原以進行性積聚的方式逐漸破壞正常肺組織結構，最終形成肺纖維化[3]，其中FB轉化為肌成纖維細胞是這個過程中的關鍵，此后肌成纖維細胞能合成大量ECM，其主要成分為Ⅰ、Ⅲ型膠原，同時又能減少ECM的降解，使其發(fā)生過度沉積，導致肺纖維化的發(fā)生[4]。馬躍文[5]及Brown[6]等認為在纖維化的過程中，細胞外基質的主要成份Ⅳ、Ⅵ膠原等逐漸被Ⅰ、Ⅲ膠原和細胞纖連蛋白等取代，Ⅰ、Ⅲ膠原構成ECM的主要成份。在試驗中也發(fā)現(xiàn)，博萊霉素可誘導小鼠肺組織成纖維細胞增生，以Ⅰ型膠原增生為主，呈現(xiàn)時間遞增關系，第28天時達高峰，因此Ⅰ型膠原作為肺組織細胞中的主要膠原成分，成為評價博萊霉素肺纖維化模型的特異指標[7]。本實驗證明SB組、SP組ECM的I型膠原含量各時間點灰度值均較M組顯著減少；SB組I型膠原灰度值均較SP組顯著升高，Ⅰ型膠原蛋白分泌明顯減少，提示抑制這兩條通路均具有改善肺纖維化的作用。

轉化生長因子β1（transforming growth factor beta l，TGF-β1）目前被大多數(shù)學者認為是肺纖維化形成和發(fā)展的關鍵細胞因子[8，9]，對ECM的生成和沉積起調節(jié)作用，還可促進成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞是纖維化的主要成份，不僅增強膠原合成，且具有收縮性，使肺組織結構破壞[10-12]。TGF-β1通過多個信號通路發(fā)揮作用，Smad3是其下游的重要信號分子之一，p-Smad3高表達與炎癥纖維化的發(fā)展密切相關。TGF-β1表達上調，促進Smad3高表達，進而促進各種促炎因子分泌，加速炎癥纖維化病變進程。本研究中M組Ⅰ膠原表達水平增高，膠原沉積明顯，與其相應的TGF-β1及其下游的Smad3 mRNA表達水平增高；在特異性拮抗劑SB431542干擾后，肺組織Smad3表達水平降低，Ⅰ膠原表達水平降低，膠原沉積減少，肺纖維化程度明顯降低。

JNK信號通路為TGF-β1下游的另一重要信號轉導通路，TGF-β1誘導纖維母細胞增殖，轉化為肌成纖維細胞及ECM，如Ⅰ、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）過度聚集的過程中起重要作用[13，14]。JNK的異常表達可影響TGF-β1的活性，進而改變纖維化的進程。本課題組前期研究曾提出，通過阻斷TGF-β介導的JNK信號轉導通路可以有效減輕肺纖維化的程度，本實驗也證明在JNK特異性拮抗劑SB600125干擾后，小鼠肺組織p-JNK蛋白表達水平降低，Ⅰ型膠原表達水平降低，膠原沉積較M組減少，肺纖維化程度明顯降低。

JNK信號通路是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的重要一員，其作為TGF-β1下游的重要信號通路，參與調控許多細胞增殖、分化與凋亡。在體外TGF-β介導的細胞轉錄過程，JNK與Smad信號傳導通路相互依賴[15]，JNK可以通過磷酸化Smad3來增強Smad信號通路，同時，Smad通路通過增加JNK誘導的轉錄因子AP-1即c-jun的活性來增強JNK信號通路[16]。通過體外實驗研究表明：JNK信號通路在TGF-β誘導的鼠腹膜間皮細胞的上皮-間質轉化中發(fā)揮重要作用，可能是通過磷酸化Smad3實現(xiàn)的[17]。Velden JL研究表明[18]，在體外實驗，JNK通過磷酸化Smad3和增強其轉錄活性來促進TGF-β誘導的EMT，同時，JNK1能調節(jié)Smad3/4復合物的核轉運并增強Smad3與Smad4之間的交互作用。本實驗表明，在小鼠肺纖維化過程中，阻斷JNK及Smad信號通路，對改善肺纖維化均有一定程度的作用，其中Ⅰ型膠原作為反映肺纖維化程度的主要指標，JNK較Smad信號通路灰度值稍高，表明Smad致纖維化程度較JNK通路明顯。

總結，本實驗證明在博萊霉素誘導的肺纖維化模型中，JNK和Smad信號通路通過增加肌成纖維細胞的形成及Ⅰ型膠原的表達致纖維化，阻斷其中任何一條信號通路，也會對另一條信號通路產生影響，抑制肺纖維化的進展。JNK及Smad途徑可以相互作用，但抑制以上途徑尚不能完全阻止肺纖維化的發(fā)展，因此肺纖維化的發(fā)病機制仍需進一步深入研究，從而為臨床肺纖維化的治療提供新思路。

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（收稿日期：2014-12-15）