羅翠婷 江富祥 陳河如1.廣東省湛江中醫(yī)學(xué)校，廣東 湛江 54094；.暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥及天然藥物研究所,廣東 廣州 51063

川西獐牙菜活性成分對NO-2的清除作用研究

羅翠婷1,2江富祥2陳河如2
1.廣東省湛江中醫(yī)學(xué)校，廣東 湛江 524094；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥及天然藥物研究所,廣東 廣州 510632

目的：分析川西獐牙菜(SwertiamussotiiFranch)的活性化學(xué)成分對亞硝基(NO2-)的清除作用，為尋找川西獐牙菜的防癌活性成分提供科學(xué)依據(jù)。方法：使用紫外分光光度法測定亞硝基的含量，根據(jù)活性追蹤的結(jié)果篩選出對NO2-有較好的清除作用的口山酮類化合物。結(jié)果：川西獐牙菜乙醇提取物的正丁醇萃取部位對NO2-的清除率最高，并篩分出清除能力最好的化合物是7-羥基-3,4,8-三甲氧基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖-口山酮苷。結(jié)論：川西獐牙菜清除NO2-的活性物質(zhì)是一些極性較大的化合物，為進(jìn)一步研究川西獐牙菜的防癌作用及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

川西獐牙菜；NO2-；口山酮；防癌作用

隨著工業(yè)化進(jìn)程的不斷加快，環(huán)境惡化日益嚴(yán)重，使人們的生活壓力不斷增加，癌癥患者的數(shù)量也迅速攀升。雖然癌癥的發(fā)病原因是多方面的，但環(huán)境污染產(chǎn)生的化學(xué)致癌物質(zhì)是導(dǎo)致癌癥頻發(fā)的重要原因之一。N-亞硝基化合物是目前所知的最強(qiáng)的化學(xué)致癌物質(zhì)之一，例如N-亞硝胺(nitrosodimethylamin，簡稱NDMA)能致人和動物多種器官發(fā)生癌變[1]。正常情況下，人們從食物中直接攝入的亞硝胺的量是非常微量的，但NO2-在體內(nèi)與胺類或酰胺類化合物相遇后可直接進(jìn)行亞硝化反應(yīng)，生成的亞硝胺具有強(qiáng)致癌性，且亞硝胺生成速度與NO2-濃度的平方成正比，嚴(yán)重危害人體健康。因此，阻斷NDMA合成或清除亞硝胺的前體——亞硝酸根是預(yù)防癌癥的有效途徑[2]。

川西獐牙菜(SwertiamussotiiFranch)為龍膽科(Geniianaceac)獐牙菜屬(Swertia)植物[3-4]，是我國青藏高原特有植物，俗稱“藏茵陳”。川西獐牙菜對肝膽實(shí)熱性疾病具有獨(dú)特的療效[5-6]，臨床上常用來治療急慢性肝炎、膽囊炎等，療效非常顯著[7]。研究發(fā)現(xiàn)川西獐牙菜不僅具有抗炎作用，而且對NO2-也有良好的清除效果，從而產(chǎn)生抗瘤防癌的作用，這可能與它們所含的口山酮、還原性糖類、生育酚等活性物質(zhì)有關(guān)。這些還原性物質(zhì)可使NO2-還原為NO，從而降低體內(nèi)NO2-含量，抑制亞硝化反應(yīng)發(fā)生的可能[8]。

本研究運(yùn)用活性追蹤的方法，通過多種分離手段得到活性單體化合物，并采用紫外分光光度法篩選出對亞硝酸根有良好清除效果的化合物，旨在尋找具有抗癌防癌活性較好的川西獐牙菜活性成分。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BRUKER AV-300和AV-400型核磁共振儀(瑞士Bruker公司)； Finnigan LCQ Advantage MAX質(zhì)譜儀(美國菲尼根公司)； Agllent1200型高效液相色譜儀Chemstion工作站(美國Agilent公司)； TU-1810S型號紫外分光光度計(jì)(日本島津)；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市金城國勝試驗(yàn)儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 薄層層析硅膠高效薄層預(yù)制板、柱層析硅膠(100-200目、200- 300目，煙臺化學(xué)工業(yè)研究所)；Sephadex LH-20(25-100μm)柱層析填料(GE Healthcare公司)；色譜純甲醇(山東禹王化工公司)；乙睛為色譜純(迪馬公司)；對氨基苯磺酸、N-1萘乙二胺鹽酸鹽、亞硝酸鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、鹽酸均為分析純；水為蒸餾水(屈臣氏)。川西獐牙菜藥材由中科院西北高原微生物研究所提供，由青海西寧孫菁副研究員鑒定為龍膽科獐牙菜屬SwertiamussotiiFranch，樣品保存于中科院西北高原微生物研究所。

2 方法

2.1 提取與分離 取2.5 kg川西獐牙菜藥材，將其研磨成粉末，用75%乙醇熱回流提取3次，過濾，將提取液合并，回收乙醇，然后在60℃真空箱干燥，得干浸膏509.7g。將浸膏研碎，溶于水中，以等體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇多次萃取，得到5個萃取部位，即石油醚部位35g、二氯甲烷部位92g、乙酸乙酯部位42.2g、正丁醇部位170g以及水部位170.5g。根據(jù)活性篩選結(jié)果，采用硅膠、Sephadex LH-20、C18以及反相HPLC等多種色譜技術(shù)，對活性部位進(jìn)行分離純化。

2.2 川西獐牙菜對NO2-的清除實(shí)驗(yàn)

2.2.1 溶液的配制 ①0.4%對氨基苯磺酸溶液的配制：稱取0.4 g對氨基苯磺酸溶于100 ml 20%鹽酸中，混合均勻，避光保存。②0.2% N-1-萘乙二胺鹽酸鹽溶液的配制：稱取0.2 g鹽酸萘乙二胺溶于100 ml蒸餾水中，混合均勻，避光保存。③亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：亞硝酸鈉預(yù)先置于硅膠干燥器中干燥24 h，準(zhǔn)確稱取0.100g，加水溶解，定容至250 ml(濃度為400μg/ml)，作為儲備液。取儲備液1.25 ml稀釋至100 ml(濃度為5 μg/ml)，待用。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 原NO2-溶液的吸光度測定[1-7]：取5μg /ml的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液3 ml，用磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液分別調(diào)節(jié)pH=3和pH=7，室溫下反應(yīng)20 min后，立即加入2 ml 0.4%對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5min后，加入1 ml 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15min，以5ml蒸餾水為空白對照，在544nm處測吸光度A2。

加入待測樣品后NO2-溶液的吸光度測定：取3mg/ml的川西獐牙菜樣品(先是川西獐牙菜的各個萃取部位，然后是正丁醇部位各流分，再是篩選后流分的單體化合物)1ml于25 ml容量瓶，加入5μg /ml的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液3ml，室溫下反應(yīng)30min后，用磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液分別調(diào)節(jié)pH =3和pH=7，立即加入2ml 0.4%對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5min后，加入1ml 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15min，以5ml蒸餾水為空白對照，在544 nm處測吸光度A1。

亞硝酸根的清除率(%)=[(A2- A1)/A2] ×100

式中A2是原NO2-溶液的吸光度，A1是加入待測樣品后NO2-溶液的吸光度。

3 結(jié)果與討論

3.1 各萃取部位對NO2-的清除率 測試樣品為萃取的4個部位，在pH=3條件下按上面步驟操作，結(jié)果見表1。

從表1中可知，正丁醇萃取部位的亞硝酸根清除率最大，而且活性比川西獐牙菜醇提的浸膏還要好，因此可進(jìn)一步對正丁醇的萃取部位進(jìn)行分離純化，旨在篩選出具有清除亞硝酸根活性好的化合物。

3.2 正丁醇部位粗分流分對NO2-的清除率 測試樣品為正丁醇部位粗分流分，在PH=3條件下按上面的步驟操作，結(jié)果見于表2。

表1 5個萃取部位的亞硝酸根清除率

表2 正丁醇部位粗分流分的亞硝酸根清除率

從表2可知，P-1到P-9各流分清除能力都不錯，可對這9個流分進(jìn)一步分離純化，尋找具有亞硝酸根清除率高的單體化合物。

3.3 正丁醇部位的分離與結(jié)構(gòu)鑒定 根據(jù)活性篩選的結(jié)果，取正丁醇P-1～P-9活性萃取部位，綜合運(yùn)用硅膠柱色譜、ODS柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜，以及反相HPLC等多種現(xiàn)代色譜分離手段，對川西獐牙菜正丁醇活性部位進(jìn)行了分離純化，通過化合物的理化性質(zhì)和現(xiàn)代波譜學(xué)手段(UV、IR、MS、HR-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR)鑒定了13個化合物的結(jié)構(gòu)。其中化合物1、化合物2、化合物3是新化合物，而化合物6、化合物8、化合物9、化合物10、化合物12為首次從該植物中分離得到。以下為化合物的結(jié)構(gòu)：

L1 R1=-Oglu, R2=R4= -OCH3，R5=-OH, R3=R6=R7=H[10]L2 R1=-Oglu, R2=R3=R7= -OCH3，R6=-OH, R4=R5=H8L3 R1=-Oglu, R2=R3= R6=R7= -OCH3, R4=R5=H[10]L4 R1=R7=-OH,R2=-OCH3,R3=R4=R5=H,R6=-O-[rha-(1→2)-glu][11]L5 R1=R7=-OH,R2=-OCH3,R3=R4=R5=H,R6=-O-[rha-(1→3)-xyl-(2→1)-rha]L6 R1=-Oglu,R2=R6=R7=-OCH3,R3=R4=R5=H[12]L7 R1=R7=-OH,R2=-OCH3,R3=R4=R5=H,R6=-O-[rha-(1→2)-xyl][13]L8 R1=R7=-OH,R2=R3=-OCH3，R6=-Oglu,R4=R5=H[13]L9 R1=R7=-OH,R2=-OCH3，R6=-Oglu,R3=R4=R5=H[14]L10 R1=-OH,R2=R3=-OCH3，R6=-Oglu,R4=R5=R7=H[15]L11 R1=R2=R4=-OH,R3=R5=R6=H，R7=-Oglu[12]L12 R1=-Oglu,R2=R6=R7=-OH,R3=R4=R5=H[16]

L13 芒果苷[16]

3.4 正丁醇部位單體化合物對NO2-的清除率 由表3可知，正丁醇部位前九個流分分離純化得到的單體化合物都有亞硝酸根清除能力，其中新化合物L(fēng)2活性最好，清除率達(dá)86.02%。另外，這些化合物在pH=3的條件比pH=7的條件下清除亞硝酸的能力要好，這對研究它在人體條件下pH對其清除率的影響提供一定的依據(jù)。

表3 正丁醇部位單體化合物的亞硝酸根清除率(%)

4 結(jié)論

本研究采用紫外分光光度法模擬在人體胃液條件下分析川西獐牙菜的活性成分對NO2-的清除作用，發(fā)現(xiàn)川西獐牙菜醇提物的正丁醇萃取部位對NO2-的清除率最高，并且對它的粗分流分進(jìn)行活性追蹤，研究發(fā)現(xiàn)川西獐牙菜清除NO2-的活性物質(zhì)是極性較大的物質(zhì)，其中新化合物7-羥基-3, 4, 8-三甲氧基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖-口山酮苷化合物清除能力最好，為尋找防癌抗癌成分提供科學(xué)依據(jù)。

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Scavenging Effect of active chemical constituents FromSwertiamussotiion NO2-

LUO Cui-ting1JIANG Fu-xiang2CHEN He-ru2

1.Zhanjiang Chinese Medicine School, Zhanjiang 524094, China；
2.Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Product, College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China

Objective To analyze the scavenging effect of active chemica constituents fromSwertiamussotiion NO2-, To provide a scientific basis for searching the anti-cancer active components fromSwertiamussotii. Method the UV spectrophotometry was used to determine the NO2-content, screening out xanthone compounds with the effect to scavenge NO2-according to the active tracking results. Results The n-butanol fraction of the ethanol extracted ofSwertiamussotiishowed a highestscavenging rate,and 7-hydroxy-3,4,8-trimethoxy-1-O-β-D-glucopyranosyl-xanthone is the best compounds from the Screening experiment. Conclusion The active substances with the effect to scavenge NO2-is high polar compounds inSwertiamussotii．This result should lay a theoretical foundation for the further research on the cancer prevention ofSwertiamussotiiand development of the relevant products．

Swertiamussotii；NO2-；xanthone；cancer Prevention

R284.2,R285.2

A

1007-8517(2015)10-0022-03

2015.02.28)