魏佳苡，魏 群，陳 靜，楊 揚(yáng)

(1.香港中文大學(xué)，香港 999057；2.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100000；3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，南充 637000；4.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100000)

鈣調(diào)蛋白磷酸酶B 亞基（Calcineurin subunit B，CNB）是鈣調(diào)蛋白磷酸酶（Calcineurin，CN）的調(diào)節(jié)亞基。正常生理狀態(tài)下，CNB 不僅存在于細(xì)胞內(nèi)，也存在于胞外，如血清中［1］。研究發(fā)現(xiàn)，CNB 除了作為鈣調(diào)蛋白磷酸酶A 亞基（Calcineurin subunit A，CnA）的調(diào)節(jié)亞基外，還有其單獨(dú)的功能［2］。對(duì)CNB 藥效的一系列研究發(fā)現(xiàn)，CNB 具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的功能［3］。而線粒體是在細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞器，故研究CNB 對(duì)線粒體凋亡途徑的影響極為重要［4］。本研究本研究采用MTT 比色法檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)、流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡測(cè)定CNB 對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果；采用高內(nèi)涵分析與成像儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)，旨在探討基因工程藥物CNB 通過(guò)線粒體途徑引起腫瘤細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑pc3.1-CNB 質(zhì)粒 、大腸桿菌菌株 、HepG2 細(xì)胞、Sk-hep1 細(xì)胞均為本室保存。蛋白預(yù)染Marker，立陶宛MBI Fermentas 公司；Anti-Calcineurin B，本實(shí)驗(yàn)室制備；Anti-?-actin，美國(guó)Santa Cruz 公司；HRP-羊抗兔二抗、HRP-羊抗鼠二抗，北京中杉金橋公司；Purified RNA extracted kit，百泰克公司；DTT，百泰克公司；DTT，德國(guó)Merck 公司；NP-40，美國(guó)Sigma公司；質(zhì)粒提取試劑盒，百泰克公司；胰蛋白酶，邁晨生物科技公司；rhCNB，本實(shí)驗(yàn)制備；dNTP、MLV-反轉(zhuǎn)錄酶、OligdT 、RNA 酶抑制劑，TAKARA 公司；Lipofectamine TM 2000，美國(guó)Invitrogen 公司。

1.2 儀器設(shè)備恒溫CO2 培養(yǎng)箱，德國(guó)HERA 公司；Coic 倒置顯微鏡，重慶光電儀器有限公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；實(shí)時(shí)定量PCR 儀7500，ABI；恒溫CO2 培養(yǎng)箱，德國(guó)HERA 公司；酸度計(jì)520A，美國(guó)ORION 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞傳代；M T T 檢測(cè)；C C K 8 細(xì)胞活性檢測(cè)；流式細(xì)胞檢測(cè)；免疫印跡；實(shí)時(shí)熒光定量P C R 實(shí)時(shí)定量P C R：引物合成序列，Primer sequences（5′-3′）：Bid，5' ACCCTAGAGACATGGAGAAG 3’（forward），5' AGCTATCTTCCAGCCTGTCT 3'（reverse）；Bak，5’ AGAGCTGTCTGAACTCACGT 3’（forward），5’TTACACTGTGCCAGAGCCAT 3’（forward）；Bim，5’ GAGAAGGTAGACAATTGCAG 3’（forward），5’ GACAATGTAACGTAACAGTCG 3’（forward）；Bcl-2，5’ CTTTAGTACAGCGGGTCA 3’（forward），5’ CTTTAGTACAGCGGGTCA 3’（forward）；Bcl-xl，5’ TCCCAGAAAGGATACAGCTGG 3’（forward），5’ACTGAAGAGTGAGCCCAGCAG 3’（forward）；質(zhì)粒提??；細(xì)胞轉(zhuǎn)染（瞬轉(zhuǎn)）；JC-1 染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)。

2 結(jié)果

2.1 CNB 有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖由圖1，我們可以看出，在體外CNB 能夠有效的抑制HepG2 細(xì)胞的增殖。CNB 對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制具有濃度依賴效應(yīng)，濃度越高，抑制率相對(duì)越高。MTT 實(shí)驗(yàn)證明，在體外CNB能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。并且，CNB 對(duì)正常細(xì)胞的增殖基本無(wú)影響。

2.2 不同批次CNB 均能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖由圖2可知，不同批次的CNB 均具有同樣的作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。但不同批次的CNB 效果不同。因此，我們?cè)谶M(jìn)行下面的研究時(shí)，選擇了藥效較高批次的CNB。

圖1 MTT檢測(cè)結(jié)果

圖2 CCK8檢測(cè)結(jié)果

2.3 CNB 能上調(diào)細(xì)胞后期凋亡比例實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

CNB 有濃度梯度效應(yīng)，隨著CNB 濃度增加，能明顯上調(diào)腫瘤細(xì)胞晚期凋亡的比例，當(dāng)濃度達(dá)到700ug/ml 時(shí)和抗腫瘤藥品五氟尿嘧啶效果基本相同，說(shuō)明CNB 能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡（圖3）。

2.4 在不同細(xì)胞系中CNB 均能上調(diào)Caspase3 的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)用western blotting 檢測(cè)Caspase 全長(zhǎng)蛋白，結(jié)果表明3 種細(xì)胞加入CNB 后均Caspase3 表現(xiàn)為下調(diào)，說(shuō)明Caspase3 剪切體上調(diào)，Caspase3 蛋白被激活，顯示CNB 能促進(jìn)細(xì)胞凋亡（圖4）。

圖3 Annexin V/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

圖4 加入CNB后3種不同細(xì)胞系Caspase3免疫印跡結(jié)果

2.5 CNB 引起細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)降低通過(guò)對(duì)CNB對(duì)線粒體膜電勢(shì)的影響的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)CNB 可以顯著減低線粒體膜電勢(shì)，因此說(shuō)明線粒體膜電勢(shì)的降低是CNB 促進(jìn)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的一個(gè)步驟。而且線粒體電勢(shì)的降低有濃度依賴性，隨著CNB 的濃度增加，線粒體電勢(shì)下降更加明顯。該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果一致，CNB 能夠定位到線粒體，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，從而引發(fā)線粒體介導(dǎo)的凋亡。見(jiàn)圖5。

圖5 .1 加入不同濃度CNB后Sk-hep1細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)情況

圖5 .2 加入不同濃度CNB后HepG2細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)情況

3 討論

細(xì)胞凋亡是程序性死亡的一種主要形式［5］。線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是細(xì)胞凋亡通路中的重要一條［6］。線粒體細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵的是細(xì)胞色素c 的釋放。當(dāng)線粒體膜通透性升高時(shí)，細(xì)胞色素c 能夠被釋放，進(jìn)入到胞漿中［7-8］。細(xì)胞色素c 的釋放有兩種途徑。一種是PTP（膜通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔）復(fù)合體，由線粒體的外膜蛋白聚合而成［9］。線粒體接收到外界的刺激以后，使得PTP 開(kāi)放、線粒體膜電位消失，線粒體的外膜裂開(kāi)，細(xì)胞色素c和AIF（凋亡誘導(dǎo)因子）釋放。另一種是Bcl-2 家族蛋白形成的通道。Bcl-2 家族可分為抗凋亡和促凋亡兩類(lèi)。其中Bcl-2 的功能是抗凋亡，而B(niǎo)ax 則是促進(jìn)細(xì)胞凋亡。兩者在線粒體上控制細(xì)胞色素c 的釋放。正常狀況下，Bcl-2 是以同源二聚體的形式存在，具有抗凋亡的作用。當(dāng)Bax 與Bcl-XL 或Bcl-2 形成異源二聚體時(shí)，這些分子的抗凋亡作用就喪失。Bax 能夠構(gòu)成跨線粒體外膜的孔道，使線粒體膜電位降低，促進(jìn)細(xì)胞色素c 和AIF 的釋放，細(xì)胞色素c 與凋亡酶激活因子1（Apaf-1）、ATP 及pro-Caspase9 形成凋亡復(fù)合體，通過(guò)pro-Caspase9 的自身酶切活化，激活Caspase9，進(jìn)一步活化Caspase3，引起細(xì)胞凋亡［9-10］。本研究重點(diǎn)探討基因工程藥物CNB 通過(guò)線粒體途徑引起腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果顯示CNB 對(duì)荷瘤小鼠有抗癌的功效。為揭示這一功效的分子水平的作用機(jī)理，我們采用MTT 比色法和CCK-8 試劑盒來(lái)檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，CNB 對(duì)HepG2 細(xì)胞和Skhep1 細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）的增殖均有較為顯著的抑制效果，而對(duì)正常細(xì)胞293t 無(wú)明顯影響，且不同批次CNB 實(shí)驗(yàn)效果有稍許差異。為了探究進(jìn)一步探究CNB 對(duì)HepG2細(xì)胞和Sk-hep1 細(xì)胞的殺傷作用，我們采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)藥物處理細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)CNB 處理后細(xì)胞處于凋亡晚期的比例明顯上升。而對(duì)凋亡經(jīng)典標(biāo)志性蛋白Caspase3 的免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示了加藥處理的細(xì)胞中Caspase3 被活化，驗(yàn)證了CNB 能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的事實(shí)。同時(shí)，經(jīng)CNB 處理后的細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)呈下降趨勢(shì)，并且有濃度梯度效應(yīng)，證明了CNB 能夠通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

需要指出的是，對(duì)CNB 的作用機(jī)理的研究仍處于初級(jí)階段，CNB 對(duì)細(xì)胞的刺激絕對(duì)不局限在這一條通路上，不同細(xì)胞可能有不同表現(xiàn)。機(jī)體對(duì)刺激的應(yīng)答是細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)通路相互協(xié)同作用的結(jié)果，通過(guò)各信號(hào)的精細(xì)調(diào)節(jié)，達(dá)到機(jī)體內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡。

由于Bcl-2 和Bcl-xl 存在于線粒體膜上，而CNB也能定位到線粒體上，所以本實(shí)驗(yàn)之后的探索研究可以從通過(guò)CoIP 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CNB 與Bcl-2 和Bcl-xl 直接結(jié)合起作用來(lái)促進(jìn)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡這個(gè)方向入手。

CNB 能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖；CNB 能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；CNB 可促進(jìn)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。

［1］ 尹虹, 劉玥, 鄭文嶺等.miRNA-196b過(guò)表達(dá)對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡及survivin、Cox-2表達(dá)的影響［J］.中國(guó)癌癥雜志, 2013, (5): 341-346.

［2］ 宋輝, 王明席, 許瑞安等.纖溶酶系統(tǒng)在成肌纖維細(xì)胞凋亡、組織纖維化過(guò)程中的作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2012, 28(6): 744-747.

［3］ Wu JS, Lin TN, Wu kk.Rosiglitazone and PPAR-gamma overexpression protect mitochondrial membrane potential and prevent apoptosis by upregulating anti-apoptotic Bcl-2 family proteins［J］.J Cell Physiol,2009.220(1): 58-71.

［4］ Sun J, Li ZM, Hu ZY, et al., ApoG2 inhibits antiapoptotic Bcl-2 family proteins and induces mitochondria-dependent apoptosis in human lymphoma U937 cells［J］.Anticancer Drugs, 2008.19(10): 967-974.

［5］ Brooks C, Dong Z.Regulation of mitochondrial morphological dynamics during apoptosis by Bcl-2 family proteins: a key in Bak［J］? Cell Cycle,2007, 6(24): 3043-3047.

［6］ Qian S, Wang W, Yang L, et al., Structure of transmembrane pore induced by Bax-derived peptide: evidence for lipidic pores［J］.Proc Natl Acad Sci U S A, 2008.105(45): 17379-17383.

［7］ Eugel T, Henshall DC.Apoptosis, Bcl-2 family proteins and Caspases:the ABCs of seizure-damage and epileptogenesis［J］? Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol, 2009.1(2): 97-115.

［8］ Rong YC, W.Distelhorst.Bcl-2 protein family members: versatile regulators of calcium signaling in cell survival and apoptosis［J］.Annu Rev Physiol, 2008, 70: 73-91.

［9］ 田朗, 朱詠貴, 成亮等.CVB3感染對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響［J］.湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2013, (3): 4-7.

［10］ 楊劍嶺, 曹曉正, 何麗華等.5, 7-二甲氧基黃酮對(duì)K562細(xì)胞凋亡和livin基因表達(dá)的影響［J］.湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2013, (4):16-18.