曾凡，鄧玉林，慶宏

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

隨著我國神州系列載人飛船的成功發(fā)射，我國的航天醫(yī)學(xué)也日漸繁榮。空間環(huán)境中包含多種對人體不利的因素，其中微重力（或稱失重）是目前為止的研究熱點。宇航員在空間環(huán)境中雖然有宇航服等保護措施，但這些措施仍然無法消除微重力。而微重力給宇航員帶來的生理改變也漸漸水落石出，不可忽視。主要有微重力可導(dǎo)致心血管功能失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致運動能力下降和立位耐力不良等[1]；微重力還可導(dǎo)致骨質(zhì)丟失骨骼肌萎縮等嚴(yán)重影響航天員健康的問題[2]；并且微

重力對免疫系統(tǒng)也有不良影響[3]。國內(nèi)外也越來越聚焦于微重力對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，并有相關(guān)報道[4～6]。盡管微重力相關(guān)報道如雨后春筍，但目前仍無關(guān)于微重力對不同腦區(qū)一氧化氮合酶活性及細(xì)胞凋亡率的影響的報道，所以本實驗試圖比較皮層和小腦經(jīng)模擬微重力刺激之后一氧化氮合酶活性的變化。本實驗旨在補充模擬失重對中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響方面的數(shù)據(jù)，為深入研究做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備和試劑

SM-31雙軸驅(qū)動框架式回轉(zhuǎn)器（中國科學(xué)院空間科學(xué)與應(yīng)用研究中心研制），解剖顯微鏡（OPTEC顯微鏡，重慶），玻璃珠滅菌儀（Keller公司，瑞士），全自動流式細(xì)胞分析儀（BACKMAN COULTER公司，美國），DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基（GIBCO公司，美國），胎牛血清（GIBCO公司，美國），Annexin V-FITC凋亡試劑盒（Miltenyi Biotec，德國），一氧化氮合成酶檢測試劑盒（碧云天公司，中國）。

1.2 微重力效應(yīng)體系的構(gòu)建

將新生SD乳鼠經(jīng)過碘酒和75%酒精擦拭全身之后，斷頭取腦，將鼠腦浸泡在D-hanks緩沖液中，并輕微沖洗以去除部分血管。在解剖顯微鏡下分離出皮層和小腦兩個腦區(qū)并將血管、腦膜剔除干凈。將得到的兩個腦區(qū)分別用組織剪剪碎及移液槍的輕柔吹打后，再用200目篩網(wǎng)過濾，得到細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液在1200rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清，用新鮮的含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度后分別接種于L-多聚賴氨酸包被的12.5cm2培養(yǎng)瓶中，并于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7天左右，隔天半量換液。當(dāng)細(xì)胞貼壁、狀態(tài)良好時，將兩種原代細(xì)胞分別隨機分為模擬微重力組（Simulated Microgravity group，SMg）和地面對照組（Control group，Ctr）。將所有培養(yǎng)瓶灌滿 DMEM/F12培養(yǎng)基，再將模擬微重力組安裝在SM-31雙軸驅(qū)動式回轉(zhuǎn)器上，設(shè)置轉(zhuǎn)速為隨機模式，將地面對照組平放在同一培養(yǎng)箱內(nèi)?；剞D(zhuǎn)一天后，取下模擬微重力組以及地面對照組，并進(jìn)行一氧化氮合成酶（NOS）活性和細(xì)胞凋亡的檢測。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測一氧化氮合成酶活性

將地面對照組和模擬微重力組的皮層、小腦的原代細(xì)胞按照一氧化氮合成酶檢測試劑盒的說明進(jìn)行操作。隨后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測原代細(xì)胞凋亡

將地面對照組和模擬微重力組的皮層、小腦的原代細(xì)胞按照Annexin V-FITC凋亡試劑盒的說明進(jìn)行操作。隨后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測的兩個腦區(qū)的一氧化氮合成酶活性

皮層和小腦的原代細(xì)胞經(jīng)過一天的模擬微重力刺激以后，與地面對照組一起按照一氧化氮合成酶檢測試劑盒的說明進(jìn)行操作，并使用流式細(xì)胞儀對其熒光值進(jìn)行檢測。按照試劑盒說明書的要求，設(shè)置一個空白對照及實驗中的模擬微重力組和地面對照組。將測得的模擬微重力組和地面對照組的熒光強度的數(shù)據(jù)分別減去空白對照的熒光強度，即為各組樣品的真實的熒光強度。再將地面對照組的一氧化氮合成酶活力設(shè)為1，將模擬微重力組的光強與之相比，得到的數(shù)值即為相對酶活力。如圖1所示，皮層原代細(xì)胞經(jīng)過模擬微重力刺激以后，酶活無顯著性差異，小腦原代細(xì)胞亦是如此。且小腦與皮層相比，兩個腦區(qū)的酶活數(shù)值幾乎相等，無顯著差異。

圖1模擬微重力對皮層、小腦兩個腦區(qū)的一氧化氮合成酶相對活性的影響（實驗結(jié)果的分析采用t檢驗，p<0.05時被認(rèn)為兩組間具有顯著差異）

2.2 流式細(xì)胞儀檢測的兩個腦區(qū)的細(xì)胞凋亡情況

皮層和小腦兩個腦區(qū)的原代細(xì)胞經(jīng)過模擬微重力處理后，與地面對照組一起按照凋亡試劑盒的說明進(jìn)行操作，并使用流式細(xì)胞儀對其熒光值進(jìn)行檢測。如圖2所示，將B2和B4象限的百分比加和，得到的數(shù)值即為凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，即圖3中縱坐標(biāo)Apoptosis%代表的數(shù)值。如將圖2中A圖所示，將B2象限的3.9%和B4象限的1.0%加和，得到4.9%，即為皮層地面對照組的凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。由圖3可見，皮層的地面對照組和模擬微重力組兩組之間的細(xì)胞凋亡率無顯著差異，小腦也是如此。皮層模擬微重力組的凋亡率會略高于地面對照組，小腦的兩組間差異很小。

3 討論

機體內(nèi)NO的形成需要一氧化氮合成酶（NOS）的參與，NOS催化L-Arg和氨作用產(chǎn)生NO和L-胍氨酸。根據(jù)NOS的組織分布等的差別，NOS可分為三種同工酶，分別是神經(jīng)元型NOS（nNOS）、誘導(dǎo)型NOS（iNOS）和內(nèi)皮型NOS（eNOS）[7]。一氧化氮作為一種非典型的神經(jīng)遞質(zhì)，近年來逐漸成為研究熱點。NO有多種生物學(xué)作用，主要參與信息傳遞、與GC結(jié)合等過程，在腦損傷、腦循環(huán)等過程中有重要的調(diào)節(jié)作用[8]。通過檢測細(xì)胞內(nèi)NOS的酶活性，可反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)NO的水平。NO是否會受模擬微重力影響，皮層和小腦的NOS活性變化幅度是否相似成為本實驗的研究目的。本實驗中使用的一氧化氮合酶檢測試劑盒可以檢測總一氧化氮合酶相對活性，但無法分別檢測三種同工酶的酶活，但總酶活的變化仍可代表腦區(qū)內(nèi)NO的產(chǎn)量變化。通過本實驗我們發(fā)現(xiàn)，一天的模擬微重力刺激并未顯著改變皮層和小腦的一氧化氮合成酶活性，且兩個腦區(qū)之間也無顯著差異，說明一天的模擬微重力沒有對這兩個腦區(qū)的NOS酶活造成影響，并且皮層和小腦在NOS活性這一方面對模擬微重力的響應(yīng)是一致的。

圖2流式細(xì)胞儀檢測的皮層、小腦原代細(xì)胞的細(xì)胞凋亡結(jié)果圖。圖中A為皮層地面對照組的細(xì)胞凋亡結(jié)果圖；B為皮層模擬微重力組；C為小腦地面對照組；D為小腦模擬微重力組

圖3模擬微重力對皮層、小腦兩個腦區(qū)的細(xì)胞凋亡率的影響（實驗結(jié)果的分析采用t檢驗，p<0.05時被認(rèn)為兩組間具有顯著差異）

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞由基因控制的程序性死亡，早期凋亡的標(biāo)志之一是位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸遷移至細(xì)胞膜外側(cè)；晚期凋亡的標(biāo)志之一則是細(xì)胞膜破損兼DNA被核酸內(nèi)切酶切割成DNA片段。流式細(xì)胞術(shù)作為一種靈敏度高、可定量的檢測方法，是目前常用的一種檢測細(xì)胞凋亡的方法，相較于形態(tài)學(xué)觀察更具有可靠性[9]。Annexin V-FITC凋亡試劑盒的原理是Annexin V可與外翻的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，由于Annexin V帶有FITC，所以可通過檢測綠色激發(fā)光的量來判斷細(xì)胞是否發(fā)生早期凋亡。當(dāng)細(xì)胞膜破損以后，碘化丙啶（PI）可與DNA片段相結(jié)合，可通過檢測紅色激發(fā)光的量來判斷細(xì)胞的晚期凋亡情況。細(xì)胞壞死也可導(dǎo)致PI與DNA結(jié)合，但壞死細(xì)胞的磷酯酰絲氨酸未發(fā)生外翻，所以Annexin V-FITC凋亡試劑盒將Annexin V和PI結(jié)合共同鑒定細(xì)胞的凋亡程度。當(dāng)細(xì)胞既不結(jié)合Annexin V又不結(jié)合PI時（Annexin V-/PI-，圖2中B3象限），說明該細(xì)胞為正?；罴?xì)胞；當(dāng)細(xì)胞為Annexin V+/PI-時（圖2中B4象限），說明細(xì)胞處于早期凋亡狀態(tài)；當(dāng)細(xì)胞為Annexin V-/PI+時（圖2中B1象限），說明該細(xì)胞為壞死細(xì)胞；當(dāng)細(xì)胞為Annexin V+/PI+時（圖2中B2象限），細(xì)胞則處于晚期凋亡狀態(tài)。

由圖3我們可以看出，雖然皮層和小腦的模擬微重力組和地面對照組相比沒有顯著差異，說明模擬微重力并不會明顯改變這兩個腦區(qū)的細(xì)胞凋亡率。但皮層的模擬微重力組比地面對照組略高，小腦的兩組幾乎持平，說明皮層對模擬微重力較小腦更為敏感，但程度有限。

皮層與小腦在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中負(fù)責(zé)不同的功能，細(xì)胞組成也有一定差異，所以模擬微重力對兩個腦區(qū)造成的影響可能會有所差異，丁桂榮等研究電磁脈沖輻射對大鼠小腦和海馬兩個腦區(qū)中一氧化氮合酶的變化，研究發(fā)現(xiàn)輻照不同時間后，海馬中NOS陽性神經(jīng)元數(shù)目顯著性下降，但小腦的NOS陽性神經(jīng)元數(shù)目在輻照之后無明顯變化[10]。李積勝等在研究睡眠剝奪對大鼠大腦皮層及海馬一氧化氮合酶的影響時發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較, 各組睡眠剝奪大鼠皮層及海馬NOS陽性神經(jīng)元數(shù)目均顯著減少，兩個腦區(qū)的變化趨勢雖一致，卻有細(xì)微的數(shù)值差別[11]，這一現(xiàn)象與本實驗皮層和小腦的細(xì)胞凋亡率的微重力響應(yīng)相似，但在NOS酶活上無明顯體現(xiàn)。

本實驗中采用的雙軸回轉(zhuǎn)器是一種可以有效模擬生物微重力效應(yīng)的設(shè)備，回轉(zhuǎn)器的內(nèi)外框在隨機模式下轉(zhuǎn)動[12]，使得回轉(zhuǎn)器上裝載的生物樣本在未來得及感受到重力的時候，重力的矢量方向就已發(fā)生了改變，其結(jié)果就是重力來不及對生物體產(chǎn)生作用，即模擬了微重力效應(yīng)[13～15]。由于航空搭載的費用昂貴、機會少以及會受其他因素的干擾（噪音、輻射）等原因，使得在真實失重環(huán)境下進(jìn)行實驗有一定難度。加之落塔提供的微重力時間太短，無法滿足長時間微重力效應(yīng)研究的需求。這些原因共同促進(jìn)了回轉(zhuǎn)器的廣泛使用?；剞D(zhuǎn)器操作簡便、可滿足長時間模擬微重力的需求，而且價格低廉，目前已成為一種模擬微重力效應(yīng)的有效手段。實驗結(jié)果表明，在雙軸回轉(zhuǎn)器上回轉(zhuǎn)過的擬南芥，其根的生長方向較對照組相比雜亂無序，與空間實驗結(jié)果一致[13]。

本實驗通過檢測SD乳鼠皮層和小腦兩個腦區(qū)的細(xì)胞凋亡率及一氧化氮合酶活性在模擬微重力刺激后的變化，發(fā)現(xiàn)一天的模擬微重力刺激對凋亡率和NOS活性均無顯著性的改變，但將皮層和小腦兩組數(shù)據(jù)相比較可以發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞凋亡方面，兩個腦區(qū)對模擬微重力的敏感程度稍有差異，說明這兩個腦區(qū)的模擬微重力響應(yīng)稍有不同。

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