薛偉麗，孫瑜，鄭凌

（武漢大學生命科學學院，武漢430072）

引言

組蛋白修飾指發(fā)生在組蛋白氨基酸殘基上的一系列化學修飾，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化和ADP核糖基化等[1,2]。組蛋白修飾是表觀遺傳學的一種主要機制，在多種生命過程中扮演著重要的角色[1,2]。其中，組蛋白甲基化因其參與了異染色質形成、基因印記、X染色體失活和基因的轉錄調控等過程，而日益受到大家重視[3]。

組蛋白甲基化轉移酶（Histone methyltransfereases,HMTs）是一類催化1～3個甲基基團轉移到組蛋白賴氨酸或精氨酸上的酶[4]，分成組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶（Histone lysine methyltransfereses, HKMTs）和組蛋白-精氨酸N-甲基轉移酶（Histone arginine methyltransferases , HRMTs）。其中，HKMTs可細分為含SET結構域和不含SET結構域的兩個亞類[5]。SET結構域由最早發(fā)現含有該結構域的3個基因，Su(var)3-9, Enhancer of zeste和Trithorax來命名。該結構域含約110個氨基酸，序列高度保守，具有獨特的折疊結構[6,7]。以酵母組蛋白甲基化轉移酶Clr4為例，其HMT催化區(qū)域含Pre-SET 序列、SET結構域和Post-SET序列（圖1）。研究發(fā)現，含有SET結構域的蛋白質多具有HMT活性。但并非所有含有SET結構域的蛋白質都能甲基化組蛋白，如甲基轉移酶Rubisco LSMT（Rubisco large subunit methyltransferase），雖然含有SET結構域，但不能甲基化組蛋白, 只能對一些非組蛋白進行甲基化修飾[8]。同樣也存在一些不含SET結構域的HMTs，如Dot1是首個被發(fā)現的無SET結構域的HKMT，可以催化H3K79甲基化[9,10]，在一定程度上擴展了HMT的研究領域。此外，不少HMTs除了能甲基化組蛋白，還能甲基化非組蛋白，并通過這種修飾來調控這些蛋白的功能[11,12]。藍色、紅色、灰色和綠色分別表示N端、Pre-SET 序列、SET結構域和Post-SET序列；圓柱形表示α螺旋、箭頭表示β折疊、線段表示無規(guī)則卷曲結構；N、C分別表示氨基酸序列的氨基端和羧基端。

圖1酵母Clr4中HMT催化結構域的模式結構圖（根據[13]進行一定修改）Fig. 1The structure of HMTase domain of histone methyltransferase Clr4 from Schizosaccharomyces pombe

G9a屬于含SET結構域的Suv39h蛋白家族的成員之一，是一種重要的常染色質HMT[14]。由于各種敲除或過表達G9a細胞系的獲得，以及全身性和多種組織特異性G9a敲除小鼠的研發(fā)，使得近年對G9a的研究進展十分迅速。本文對G9a結構和功能上的最新研究進展做一綜述，并就其在多種疾病的預防與治療中的作用進行相關展望。

2 G9a的發(fā)現與結構特點

G9a，又稱常染色質組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶2 （euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2,EHMT2），在Homo sapiens中由EHMT2基因編碼[15]。研究發(fā)現其C端含有SET結構域，并且與兩個富含半胱氨酸的區(qū)域相鄰，具有HMT活性[16]。

G9a在哺乳動物中序列十分保守[17]，人源、牛源、大鼠與小鼠的G9a同源性高達95.0%。小鼠G9a的N端含富含谷氨酸和半胱氨酸區(qū)域，可能參與G9a自身的甲基化[18]，并含有核定位信號（NLS）；中間區(qū)域是G9a的功能核心區(qū)域，由具有錨定功能的六組Ankyrin（ANK）重復序列組成，形成α螺旋-β轉角-α螺旋-β轉角的空間結構，用于對底物的甲基化位點識別[19]；C端區(qū)域主要是SET結構域，行使蛋白甲基化功能[20]。在SET結構域的前后分別有Pre-SET和Post-SET序列，分別起著穩(wěn)定G9a蛋白結構和促進甲基化酶活性中心形成的作用[21]（圖2）。一般說來，G9a有兩種不同長短的異構體。長異構體（L-G9a）表達全長的G9a氨基酸序列，而短異構體（S-G9a）在N端存在一段氨基酸的缺失[22](圖2)。但這兩種異構體在功能上的差異還有待進一步研究。

G9a在多種組織中廣泛表達。我們檢測了正常小鼠不同組織中G9a的表達情況（圖3A）。結果表明，G9a在肌肉、心臟、腦等組織中高表達，而在白色脂肪、脾臟及肺等組織中表達較低。即使在同一種組織的不同類型細胞中，G9a的表達量也有較大差異。我們發(fā)現在體外培養(yǎng)的大鼠視網膜不同細胞系中，G9a在神經節(jié)細胞系RGC-5中的表達量明顯高于其在神經膠質細胞系rMC-1中的表達量（圖3B）。我們進一步發(fā)現G9a在人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y中表達量也較高（圖3B）。

3 G9a調控基因轉錄的功能

3.1 G9a通過甲基化組蛋白來抑制基因轉錄

G9a是繼Suv39h1后發(fā)現的第二個哺乳動物中甲基化賴氨酸的HMT，主要催化組蛋白H3K9和K27位點。G9a 將甲基從SAM（S-adenosyl-l-methionine）上轉移到目的賴氨酸殘基的ε—氨基上[16]。Suv39h1/h2和G9a都可以催化H3K9位點的單、雙以及三甲基化反應[23,24]，其中Suv39h1/h2催化組蛋白H3K9異染色質區(qū)域的甲基化，而G9a則催化其在常染色質區(qū)域的甲基化[14, 25, 26]。

圖2鼠源G9a的兩種異構體結構示意圖[22]Fig. 2Schematic information about different domains of mouse G9aNLS：核定位信號；E：谷氨酸富集區(qū)；Cys：半胱氨酸富集區(qū)；ANK：ANK重復序列；Pre-SET：Pre-SET序列；SET：SET結構域；Post-SET：Post-SET序列；數字表示氨基酸殘基

圖3不同組織和細胞中G9a的表達情況Fig. 3The expression pattern of G9a in different mouse tissues and cultured cell linesA. 雄性C57BL/6小鼠（3個月大）不同組織中G9a的表達情況（上圖）和相應樣本中考馬斯亮藍的染色結果（下圖）。B. 不同類型的細胞中G9a的表達情況（上圖）和相應樣本中β-actin的表達情況（下圖）。

G9a與GLP（G9a-like protein）關系密切，人源G9a與GLP的相似度達到45%，主要在N端存在較大差異[27]，兩者結構也極其相似[28]。體外實驗表明，兩者都有H3K9甲基化酶活性，可以單獨行使HMT功能[16,23,29]。但體內研究卻發(fā)現，兩者通常通過SET結構域形成異二聚體，共同行使HMT功能。在細胞內單獨敲除任何一個，都會造成H3K9me1和 H3K9me2水平顯著性下降；但兩者的雙敲除不會進一步降低H3K9me1和H3K9me2水平[20]，表明兩者不能補償對方的甲基化酶功能的缺失。

化合物BIX01294和UNC0638特異性抑制負責甲基化H3K9位點的HMTs活性，構象研究發(fā)現它們通過占據HMTs中與底物結合的部位，從而抑制甲基化反應[30]，用它們處理細胞都可以顯著性降低H3K9me2的水平[24,31]。 BIX01294被認為是G9a的特異性抑制劑，UNC0638是G9a及GLP的甲基化酶活性抑制劑，比BIX01294具有更強的抑制作用[32]。

由于H3K9位點的單/雙甲基化（H3K9me1/2）和H3K27位點甲基化（H3K27me）會募集抑制子，如HP1家族成員，導致DNA和組蛋白結合更加緊密，從而抑制基因轉錄[33]。因此，G9a可以通過其HMT活性對一些基因的啟動子區(qū)域上的組蛋白進行H3K9和H3K27位點的甲基化修飾，從而調控基因的轉錄沉默[34]。同時，生物芯片結果顯示，胚胎干細胞中G9a的缺失可以激活一系列啟動子區(qū)域富含H3K9me2的基因的表達[35]，表明G9a抑制基因轉錄是廣泛存在的。

3.2 G9a通過維持啟動子區(qū)域DNA甲基化來抑制基因轉錄

G9a不僅能調控組蛋白的甲基化，而且也能調控DNA甲基化程度。與組蛋白修飾相同，DNA甲基化也是一種表觀遺傳修飾，是指在DNA甲基轉移酶（DNA methylation transferase，DNMT）的作用下，DNA鏈上CG中的胞嘧啶接受一個甲基形成5'-mCG-3'[36]。因此，DNA甲基化多發(fā)生在5'-CG-3'富集區(qū)域。DNMTs主要分為兩大類，DNA甲基化維持酶DNMT1和DNA從頭甲基化酶DNMT3a、DNMT3b及DNMT3L等[37]。DNA甲基化通常與基因轉錄抑制相關，在哺乳動物的胚胎發(fā)育和細胞分化過程中起著不可或缺的作用，其異常也與多種疾病如腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[38]。

研究表明，在胚胎干細胞中敲低G9a會引起下游靶基因Mage-a2啟動子和Wfdc15a的5'UTR區(qū)域甲基化程度下調[39]。對該種細胞整個基因組的DNA甲基化水平進行研究發(fā)現，G9a缺失會造成大部分CpG島中CG位點的低甲基化狀態(tài)，特別是逆轉錄轉座子和衛(wèi)星DNA區(qū)域的甲基化顯著減少[40,41]。

G9a一方面可通過其甲基化酶活性來調控DNA的甲基化。研究發(fā)現在粗糙脈孢菌和植物中，H3K9的甲基化可以調控DNA甲基化水平[42,43]。在小鼠胚胎干細胞DNA復制過程中，半甲基化DNA和復制叉處的H3K9me2/3可先招募UHRF1（Ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains,1），定位于復制叉上的UHRF1進而招募DNMT1完成DNA全甲基化[44]，從而實現DNA甲基化在細胞增殖過程中的延續(xù)。另一方面，G9a還能直接通過DNMTs來調控DNA甲基化水平。多種細胞實驗表明，在DNA復制過程中，DNMT1和G9a相互結合來維持DNA復制過程中甲基化信息的傳遞[45]。除了DNMT1之外，G9a還通過ANK結構域募集DNMT3a和DNMT3b，來維持基因啟動子上DNA甲基化，從而調控基因沉默[46]。這種G9a調控DNA甲基化的方式并不依賴其甲基化酶活性，因為在G9a敲除的胚胎干細胞中過表達SET結構域缺失的G9a，仍然可以改善由于G9a敲除引發(fā)的逆轉錄轉座子低甲基化狀態(tài)[40]。此外，G9a 的SET結構域點突變也不影響G9a和DNMT3a/3b的相互作用[46]。因此，在G9a通過DNMTs來調控DNA甲基化的過程中，G9a一般扮演著腳手架蛋白的作用，與DNMTs共同調控基因沉默。

3.3 G9a作為腳手架蛋白募集轉錄激活子從而激活基因轉錄

Bittencourt等在對敲低G9a的人肺癌A549細胞進行基因表達譜分析中，發(fā)現在200個差異表達的基因中，有約25%的基因表達顯著降低[47]，這與G9a的轉錄抑制作用不符。不僅在肺癌細胞中，在乳腺癌細胞中，G9a的敲低可以正調控一部分雌激素誘導的靶基因表達，同時抑制另一部分靶基因表達[48]。同樣的，在神經母細胞瘤細胞和骨肉瘤細胞中，過表達G9a可以促進細胞周期相關基因的表達。這些數據都表明在某些特定條件下，G9a對基因轉錄有激活作用。

進一步研究表明，G9a可與多種轉錄激活子相互結合，來協同激活基因轉錄。例如，在類固醇激素受體調控其靶基因轉錄的過程中，類固醇激素的刺激可以誘導 G9a募集該受體，并通過G9a結構域進一步募集，如谷氨酸受體相互作用蛋白（Glutamate receptor interacting protein1, GRIP1）、精氨酸甲基化酶（Coactivator-associated arginine methylthrasferase,CARM1）和組蛋白乙酰化酶p300（E1A binding protein p300,p300）等轉錄激活子，形成巨大的轉錄復合體，協同促進下游靶基因的轉錄[49]。在糖皮質激素受體誘導下游基因表達的過程中，也存在著相似的G9a激活基因轉錄的作用。在人肺癌細胞中，G9a在糖皮質激素刺激下，能夠募集CARM1和p300到糖皮質激素受體調控的靶基因ENaCα和CDH16的啟動子上，促進這些基因的轉錄[47]。在這些過程中，G9a與激活子協同激活基因轉錄的作用并不依賴其甲基化酶活性，而是通過其相關結構域來募集其它轉錄激活子[47,49]。

4 G9a參與多種生物反應過程

由于其在基因轉錄上的重要調控作用，所以G9a對機體的生長和發(fā)育是至關重要的。最直接的證據是全身性G9a敲除小鼠胚胎致死[14,20]。通過對G9a全身性和條件性敲除小鼠的研究，發(fā)現該蛋白與胚胎發(fā)育、生殖細胞的發(fā)育及減數分裂、腫瘤細胞的生長及轉移、認知及適應性行為和脂肪細胞分化等生物過程都有著密切聯系。

4.1 G9a 與胚胎發(fā)育

G9a全身敲除小鼠由于嚴重的發(fā)育缺陷，在胚胎9.5天（ED9.5）左右死亡[14,20]。由于G9a SET結構域突變的小鼠也像全身敲除小鼠一樣，具有胚胎致死的表型[14,20]，因此胚胎的正常發(fā)育需要G9a的HMT活性。缺乏G9a或其HMT活性使得小鼠胚胎中H3K9me2水平顯著下降，同時H3K4甲基化水平顯著升高[14,20]，因此推測這兩種組蛋白甲基化修飾的改變，共同抑制了發(fā)育過程中某些關鍵基因的表達，從而引發(fā)胚胎致死。進一步研究表明，G9a全身敲除小鼠的胚胎中，細胞凋亡的數目明顯增多[50]，這和細胞水平上G9a敲除能引發(fā)自噬，從而引起細胞死亡是相符的[51,52]，但遺憾的是，論文作者并沒有對這一方面進行深入研究，因此，G9a調控胚胎發(fā)育的具體機制仍需進一步研究。

在生殖細胞中特異性敲除G9a，導致生殖細胞無法進行減數分裂，從而引發(fā)生殖細胞發(fā)育缺陷[50]。在該品系小鼠的生殖細胞中，H3K9me1/2水平下降，但H3K9me3的水平不變。由于H3K9me1/2在常染色質結合相關蛋白的過程中充當腳手架作用，而這些結合的蛋白在同源染色體聯會階段幫助同源染色體正確配對[53]，因此，G9a的敲除通過降低H3K9甲基化修飾影響常染色質相關結合蛋白的募集，使得減數第一次分裂時同源染色體不能完成聯會，從而無法進行正常減數分裂[50]。

4.2 G9a與腫瘤

在多種癌癥患者，如肝癌、膀胱癌、骨髓癌、結腸癌和前列腺癌等癌變組織中都發(fā)現G9a高表達[54]。與此同時，在各種人癌細胞系中，例如乳腺癌、結腸癌、膀胱癌和肺癌等細胞系中，G9a也出現高表達[54,55]。肺癌患者尸檢結果顯示肺組織中G9a的表達水平與病情進展以及愈后性呈正相關[56]，但具體機制并不清楚。在一些腫瘤細胞系中，G9a異常表達可以顯著地促進細胞增殖，并促進與細胞周期相關的基因如Cyclin A2和Cyclin B1的表達，也可以顯著地增強腫瘤細胞的非貼壁性生長[52]。相反的，在體外敲低G9a可以顯著抑制癌細胞的生長[57]。裸鼠致瘤實驗也表明，敲低G9a可以顯著抑制癌細胞的侵襲轉移[56]。這些都表明G9a與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有著密切關系，抑制G9a也許是治療癌癥的有效措施。

那么G9a對癌細胞生長的調控是否需要其HMT活性呢？現有的研究并沒有得出一致的結論。Ding研究組表明G9a可以通過單甲基化PHGDH、SHMT2等基因的H3K9位點，從而激活絲氨酸-甘氨酸合成途徑，而該途徑是氨基酸、核苷酸和脂類等大分子生物合成的前體以及輔酶的重要來源，在促進癌細胞增殖和存活的過程中發(fā)揮關鍵作用[52]。Huang等人也證實，在乳腺癌細胞中，G9a可以雙甲基化p53，一種非常重要的抑癌基因，從而造成p53抑癌功能的失活；而敲低G9a后，p53恢復活性，造成凋亡細胞的數目明顯增多[54]。Chen等人在研究中雖然發(fā)現G9a可以沉默上皮細胞粘附分子Ep-CAM，從而促進肺癌細胞的入侵和轉移，但在肺癌細胞中H3K9me2的水平與G9a的表達水平并不對應，因此，G9a對該基因表達的抑制很可能不依賴其甲基化酶活性，而是通過調控DNA甲基化水平實現的[56]。

近年來，多個實驗室在多種不同組織來源的癌細胞系以及一些癌癥患者的原代細胞中發(fā)現，利用siRNA技術或者特異小分子抑制劑來降低G9a水平或其HMT活性，可以造成細胞自噬的過度激活，引起關鍵細胞組分的過度消耗，進而造成細胞自噬性死亡[51,52]。這種細胞死亡是caspase非依賴性的，有別于經典的細胞凋亡[51]。抑制G9a引發(fā)細胞自噬性死亡的分子機制現有兩種解釋：一種是抑制G9a可以引起細胞內活性氧基團（ROS）的積累[51]，持續(xù)的 ROS可以引發(fā)自噬，從而引起癌細胞的自噬性死亡。然而，G9a的下調是如何造成細胞內ROS的積累還需要進一步闡明。另一種是抑制G9a可以顯著抑制絲氨酸-甘氨酸合成途徑，造成細胞內能量缺失，繼而引發(fā)癌細胞的自噬性死亡[52]。雖然抑制G9a引發(fā)細胞自噬性死亡的分子機制并沒有完全研究清楚，但是兩個研究共同表明G9a的抑制劑可以作為癌細胞自噬的誘導劑，為癌癥治療提供新思路。

4.3 G9a 與神經系統疾病

對前腦神經元特異性G9a敲除小鼠的研究發(fā)現，該品系小鼠雖然沒有明顯的神經元發(fā)育缺陷，但由于神經細胞內H3K9me2水平下降，造成大量基因表達上調，特別是重新激活了Dach2，一個只在胚胎期表達的轉錄因子[58]。人類的DACH2基因位于X染色體中與多種智力發(fā)育遲滯有關的區(qū)域上[59]。因此，該品系小鼠成年后表現出認知水平和適應環(huán)境的能力下降，這種表型類似于人類第9號染色體缺陷引發(fā)的智力發(fā)育遲滯綜合征[58]。這種G9a在神經元中的作用在進化上是保守的，因為G9a缺陷的果蠅在學習和記憶方面也出現明顯缺陷[60]。

除了對學習和記憶有影響外，G9a在可卡因成癮方面也起著關鍵的作用。反復的可卡因刺激會改變小鼠伏隔核神經元中部分基因的表達，進而改變神經元的形態(tài)，表現出明顯的可卡因成癮。進一步檢測發(fā)現，G9a 和 GLP 在這種小鼠的伏隔核神經元中表達水平明顯下降，相應的，H3K9me2水平也顯著性下降[61]。利用伏隔核神經元特異性的G9a轉基因和敲除小鼠進一步研究，證明G9a及其介導的H3K9me2在可卡因誘導的神經反應中起著關鍵作用[61]。因此，調控G9a水平或其HMT活性有可能成為治療可卡因成癮的新靶標。但該文章并沒有進一步研究GLP，是否調控GLP水平也能達到調控H3K9me2水平，從而影響小鼠的可卡因成癮性呢？還需要設計相關實驗來進一步證明G9a對可卡因成癮調控的特異性。

4.4 G9a與脂肪形成

在脂肪細胞分化過程中有兩類重要的轉錄因子，PPARγ（Peroxisome proliferator-activated receptors γ，過氧化物酶體增殖激活受體γ）會促進脂肪分化，而Wnts會抑制脂肪分化[62～64]。研究發(fā)現，在3T3-L1前脂肪細胞中PPAR γ的整個基因富含H3K9me2，并在脂肪分化過程中該基因上的H3K9me2水平和G9a水平明顯下降[65]。在棕色前脂肪細胞和3T3-L1細胞中敲低G9a，引發(fā)H3K9me2整體水平下降，可以促進PPARγ的表達和脂肪細胞分化[65]。與之對應的是，在3T3-L1細胞中過表達G9a可以抑制脂肪細胞分化。有趣的是，在脂肪分化過程中，G9a對PPARγ的調控依賴其HMT活性，而對Wnt10a的表達調控不依賴其HMT活性[65]。更重要的是，在正常食物喂養(yǎng)條件下，脂肪組織特異性G9a敲除小鼠的脂肪重量明顯增加[65]， 進一步證實了G9a抑制脂肪分化和累積。

5 結語

傳統上認為，G9a的主要作用是對常染色體上的組蛋白進行甲基化，進而抑制相關基因轉錄。但最新研究表明G9a也可以作為腳手架蛋白來募集轉錄激活子，從而激活特定基因轉錄。近些年越來越多的科學家致力于研究G9a在基因轉錄調控中的雙重作用，并闡明其生物學意義。因此，進一步篩選出與G9a有相互作用的蛋白，闡明G9a調控基因轉錄的具體機制，以及G9a在生理和病理條件下對信號通路的影響，都將有望更加全面地了解G9a的功能，并為相關疾病的預防和治療提供新思路、新靶點。

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