谷春秀，程夢威，劉露，于亞萌，張童，鮑尹聰

（北京聯(lián)合大學生物化學工程學院，北京100023）

引言

左卡尼汀作為一種有效的活性氧物質清除劑，可加快缺血缺氧組織堆積的脂酰輔酶A進入線粒體內，在緩解氧化應激、減少脂質過氧化、釋放腺嘌呤核苷酸轉位酶、促進脂類代謝、抗細胞凋亡等過程中作用明顯[1～5]。左卡尼?。↙-carnitine, LCA），又稱左旋肉堿。肉堿分子中含有1個手性碳原子（見圖1），形成左旋（L-）、右旋（D-）肉堿對映異構體。右旋肉堿對肉堿乙酰轉移酶（CAT）和肉堿脂肪酰轉移酶(PTC)有競爭性抑制作用，在生化過程中產(chǎn)生毒副作用[6,7]。左卡尼汀片中雜質右旋卡尼汀的存在明顯影響藥品質量的安全有效。藥品中右旋卡尼汀含量超標容易產(chǎn)生胃腸道反應，造成患者惡心和嘔吐、甚至過敏反應，大劑量的情況下對人和動物有害[6]。美國FDA于1993年就禁止出售D-型和DL-型肉堿[7]。國內外目前對左卡尼汀片中右旋卡尼汀測定的研究報導較少。分離卡尼汀對映體時須用手性拆分技術，酶解[8]、手性衍生化[9～11]、手性固定相[11]法常被用于左右旋肉堿拆分。國外尚未有左旋肉堿對映體拆分后含量檢測的研究報道。美國藥典25版及藥典論壇和其他文獻資料對左卡尼汀中手性雜質控制方法有少量的報道[12]，也曾提供過方法和檢測限度，都是衍生后用HPLC分析，但是過程復雜，重復性較差，根據(jù)《手性藥物質量控制研究指導原則》、美國藥典25版及其論壇（pharmacopeial forum）左卡尼汀專論部分規(guī)定控制了左卡尼汀原料右旋體的限度，限度為1.0%。國內在此方面的研究仍是空白。左卡尼汀片雜質右旋卡尼汀含量的測定方法研究，為市售左卡尼汀中雜質限量、質量控制提供技術支持，促進此類制藥生產(chǎn)的良性運作。

圖1肉堿的結構式

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

島津2010HT高效液相色譜儀（日本島津公司）； 2140型電子分析天平（上海奧豪斯公司）Mettler AB135 -S十萬分之一電子天平（瑞士Mettler公司）。

1.2 實驗材料

左卡尼汀片（批號：120901, 120902, 120903）北京嘉事大恒制藥有限公司；對照品DL-肉堿（批號：20111201純度為98.69%）武漢福鑫化工有限公司；乙腈為色譜純（J.T.Baker公司）；高氯酸鈉為分析純（天津科密歐化學試劑有限公司）；高氯酸為分析純（天津政成化學制品有限公司）；α-溴代苯乙酮（MW=199.04）為化學純（批號：T20110602）（國藥集團化學試劑有限公司）；無水乙醇、乙酸乙酯為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；氫氧化鉀、無水冰醋酸為分析純（北京化工廠）；醋酐為分析純（天津多利精細化工有限公司）；水為純化水。

1.3 溶液制備

1.3.1樣品衍生化制備供試液

取一定濃度的左卡尼汀33%的乙醇溶液10mL置100ml圓底燒瓶中，搖勻后，向其中滴加一滴酚酞指示液，加入一滴1mol/L的KOH溶液，使之紫紅色不退，加入а-溴代苯乙酮（MW=199.04）26.0mg，搖勻后，加熱回流，使圓底燒瓶中液體保持微沸，從冷凝管流出液體開始計時，加熱回流30min，回流過程中不時振搖溶液，冷卻至室溫后，向圓底燒瓶中加入50ml乙酸乙酯，混合搖勻，轉入分液漏斗中，搖勻靜置后，取下層水相作為備用溶液，精密移取此備用液1.0ml，置5ml容量瓶中，加入水稀釋至刻度，即得供試液。

1.3.2空白衍生溶液

精密移取33%的乙醇溶液10ml置100ml圓底燒瓶中，按樣品衍生化過程衍生后，得下層水相備用液，精密移取此備用液1.0 ml，置5ml量瓶中，加入水稀釋至刻度，即得供試液衍生溶液。

1.3.3空白輔料衍生溶液

精密稱取處方量的輔料約2.2g，置100ml量瓶中，加33%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，精密移取離心后的上述溶液的上清液2.0mL置25ml量瓶中，加33%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，按樣品衍生化過程衍生后，得到下層水相備用液，精密移取此備用液1.0ml，置5ml量瓶中，加入水稀釋至刻度，即得空白輔料衍生溶液。

1.3.4左卡尼汀片(L-carnitine tablets)供試溶液

取左卡尼汀片20片（批號：120901）精密稱定，研細，精密稱取藥物粉末適量（約相當于左卡尼汀2.5g），置100ml量瓶中，加33%的乙醇溶液稀釋至刻度后按1.3.2方法處理后加入水稀釋至刻度，即得左卡尼汀片供試衍生溶液。

1.3.5右卡尼汀（D-carnitine）對照衍生溶液

精密稱定DL-肉堿標準品約100mg（相當于D-carnitine對照品50mg），置25ml量瓶中，加33%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，精密移取上述溶液5.0ml，置100ml量瓶中，加33%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，精密移取上述溶液5.0mL置25ml量瓶中，加33%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。按樣品衍生化過程衍生后，得到下層水相備用溶液，精密移取此備用溶液1.0ml，置5ml量瓶中，加入水稀釋至刻度，即得右卡尼?。―-carnitine）對照衍生溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱為phenomenex LUX Cellulose-1（250×4.6mm，5μm）；流動相A為乙腈；流動相B為0.5mol/L高氯酸鈉溶液（0.1M高氯酸溶液調節(jié)PH值3.8）；梯度洗脫見表1；柱溫為28℃；檢測波長235 nm；流速為0.4mL·min-1，進樣量為10μl。

表1梯度洗脫程序

1.5 測定方法

1.5.1專屬性實驗

精密移取離心后的左卡尼汀片（L-carnitinetablets）供試溶液上清液2.0ml和右卡尼?。―-carnitine）對照溶液5.0ml，各置25ml量瓶中，加33%的乙醇溶液稀釋至刻度，得到左卡尼汀（L-carnitine）供試液和D-carnitine對照供試液。進行衍生過程試驗，即得左卡尼汀供試衍生溶液和D-carnitine對照衍生溶液，同法制備空白溶劑衍生溶液和空白輔料衍生溶液。按色譜條件進行分析。記錄色譜圖。

1.5.2系統(tǒng)適用性

精密移取右旋卡尼?。―-carnitine）對照溶液衍生后的溶液，分別進樣6次，記錄色譜圖，以6次的峰面積計算RSD%值。

1.5.3樣品測定右卡尼汀參照高效液相色譜法（附錄V D）測定（1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

用纖維素-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）硅膠鍵合相手性色譜柱（Phenomene Lux 5u Cellulose-1色譜柱），以0.5mol/l高氯酸鈉溶液（用高氯酸調節(jié)PH3.8）為流動相A，乙腈為流動相B，按表1進行梯度洗脫，流速為0.4ml·min-1，檢測波長為235nm，柱溫28℃。精密量取供試衍生溶液和對照衍生溶液各10.0μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，若供試衍生溶液中有右旋卡尼汀衍生物峰，按外標法以峰面積計算。

（2）測定方法

左卡尼汀供試品溶液見1.3.4，D-carnitine對照品溶液見1.3.5。精密移取供試品溶液和對照品溶液分別10ml，各置100ml圓底燒瓶中，搖勻后，各滴加一滴酚酞指示液按1.3.2得對照品、供試品衍生溶液。照上述條件同法測定，按外標法以峰面積計算。

1.6 方法學考察

1.6.1線性與范圍

分別精密移取專屬性實驗項下的D-carnitine 對照品衍生備用溶液0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.80ml、1.00ml、1.20ml各置5ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得線性測定1～6號溶液，各精密移取上述線性測定1～6號溶液各10.0μl，按色譜條件進樣，記錄色譜圖。

1.6.2重復性

右卡尼汀對照品衍生溶液同1.3.5，供試品衍生溶液同1.3.4，平行制備6份供試樣品衍生溶液。分別取上述對照品衍生溶液和供試品衍生溶液各10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.6.3溶液穩(wěn)定性

在室溫條件下將供試品衍生溶液同1.3.4放置于0、2、6、10、12小時分別進樣10μl，記錄色譜圖。

1.6.4回收率

各平行制備三份低、中、高濃度加標供試樣品衍生溶液（n=9)。取右卡尼汀(D-carnitine)對照品衍生溶液及低、中、高濃度加標供試樣品衍生溶液各10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.6.5耐用性

按照個人所得稅法有關規(guī)定，農民進城務工勞務所得、經(jīng)營所得、工資所得等，收入達到個稅起征要求也需要繳納個人所得稅，如月工資、薪金超過5000元需繳納個稅，勞務報酬每次超過800元需繳納個稅等。但是進城務工人員工作相對不易，與城鎮(zhèn)居民納稅人又承擔相等的納稅義務，稅負較重，進城后生活狀況改善有限，整體公平性并未實現(xiàn)。

精密移取對照品衍生溶液見1.3.5、供試品衍生溶液見1.3.4各10μl注入色譜儀中，記錄色譜圖。

2 結果與與討論

2.1 專屬性實驗

專屬性實驗結果見表2匯總表。記錄色譜圖見圖2。

表2專屬性實驗結果匯總表

*N/A表示不適用，圖譜中未出現(xiàn)該右卡尼汀衍生物色譜峰

專屬性試驗圖譜如下：

圖2專屬性試驗譜圖圖中阿拉伯數(shù)字1表示為空白衍生溶液色譜圖2表示為空白輔料衍生溶液色譜圖3表示為供試品衍生溶液色譜圖4表示為對照品衍生溶液色譜圖

空白輔料、空白溶劑不干擾供試品中右卡尼汀衍生物峰的測定，對照品及供試品中右卡尼汀衍生物峰峰形良好，理論塔板數(shù)大于5000，右卡尼汀衍生物峰與左卡尼汀衍生物峰分離度大于1.5，因此表明本方法專屬性好。

2.2 系統(tǒng)適用性

以6次的峰面積計算RSD%，結果見表3。

右卡尼汀衍生物峰與左卡尼汀衍生物峰峰形良好，兩峰分離度大于1.5，右卡尼汀衍生物峰理論塔板數(shù)大于5000，峰面積及峰保留時間RSD%（n=6）均小于2.0%，表明本方法系統(tǒng)適用性較好。

2.3 方法學考察

2.3.1線性與范圍

表3系統(tǒng)適用性實驗結果匯總

表4線性與范圍試驗結果匯總表

圖3線性范圍關系圖

由以上試驗可知，右卡尼汀在濃度1.978μg/ml～23.741μg/ml范圍內線性關系良好，回歸方程為A=4652C+282.70，相關系數(shù)r=1，完全滿足左卡尼汀片中右卡尼汀手性雜質的檢查要求。

2.3.2定量限、檢測限

根據(jù)系統(tǒng)適用性試驗項下對照品衍生溶液色譜圖信噪比(S/N）為1109.36，將線性1號溶液稀釋10倍，即可得到定量限，這時稀釋樣品圖譜的信噪比為9.68，可以作為定量限樣品溶液。將線性1號溶液稀釋50倍，即可得到檢測限，這時稀釋樣品圖譜的信噪比為2.22，可以作為檢測限樣品溶液。因此方法檢測的定量限為1.98ng，相當于定量檢測左卡尼汀片中手性雜質右卡尼汀的限度為0.01%,檢測限為0.4ng，相當于最低檢測左卡尼汀片中手性雜質右卡尼汀的限度為0.002%，遠低于規(guī)定左卡尼汀片中手性雜質右卡尼汀的限度1.0%的要求，說明本檢測方法靈敏度高，符合樣品檢測右卡尼汀手性雜質的要求。

圖4線性測定色譜圖

2.3.3重復性

分別取1.6.2對照品衍生溶液和供試品衍生溶液各10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算含量，結果見表5。

表5 樣品重復性試驗結果匯總表

以上試驗結果表明，本方法的重復性良好。

2.3.4溶液穩(wěn)定性

考察供試品衍生溶液穩(wěn)定性，計算右卡尼汀衍生物色譜峰面積，結果見表6。

表6溶液穩(wěn)定性考察結果匯總表

試驗結果表明，供試品衍生測定溶液放置12小時后，峰面積RSD=0.74%，同時色譜峰能完全分離，說明供試品衍生測定溶液在室溫條件下至少12小時內是穩(wěn)定的。

2.3.5回收率

取右卡尼?。―-carnitine）對照品衍生溶液及低、中、高濃度加標供試樣品衍生溶液（n=9同1.6.4）各10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算回收率，結果見表7。

表7不同濃度回收率結果

以上結果表明，高、中、低三個濃度9個加標供試測定溶液的加樣回收率均在80%～120%之間，回收率平均值為97.83%，RSD值為5.0%，說明回收率良好。

2.3.6耐用性

取對照品衍生液、供試品衍生液各10μl進樣，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算含量，耐用性試驗結果如表8。

表8耐用性試驗結果

改變流速、柱溫、流動相比例、PH值，供試品溶液中右卡尼汀測定結果為0.07±0.02%，說明本法耐用性較好。

在耐用性實驗前為考察色譜條件的微小變化對本品中右卡尼汀手性雜質檢查結果的影響，分別考察了流速、柱溫、流動相比例、流動相PH值的變動對測定結果的影響：

①改變流速±10%（1、0.3ml/min；2、0.4ml/min）

②改變柱溫±5℃（1、23℃；2、33℃）

③改變初始流動相有機相比例±5%（1、高氯酸鈉溶液：乙腈=73:27；2、高氯酸鈉溶液：乙腈=83: 17）

④改變PH±0.2（1、pH 3.6；2、pH 4.0）

實驗中采用梯度洗脫，隨著乙腈比例的增加，保留時間縮短較快。高效液相色譜法在對映異構體的分析中較為常用，但可用于L-肉堿與D-肉堿分析的方法卻較少[7,13～17]。主要由于肉堿極性很大，在色譜柱上保留不好，同時在紫外可見光區(qū)吸收極弱，靈敏度不夠。

2.4 樣品測定

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 精密量取對照品衍生溶液10μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，右卡尼汀衍生物峰理論塔板數(shù)計算不低于5000，左卡尼汀衍生物峰與右卡尼汀衍生物峰分離度應不小于1.5，調節(jié)右卡尼汀衍生物峰高為滿量程10%～20%。精密量取供試衍生溶液和對照衍生溶液各10.0μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，若供試衍生溶液中有右旋卡尼汀衍生物峰，按外標法以峰面積計算，即得則不得過1.0%。

測定法 三批樣品照高效液相色譜法（中國藥典2010年版附錄VD測定，結果見表9。

表9樣品雜質測定結果

3 結論

本法適用于左卡尼汀片中右卡尼汀手性雜質檢查，三批樣品中雜質含量均在0.1%以下，遠低于限度1.0%。通過方法學驗證：專屬性及系統(tǒng)適用性、重復性、線性關系與范圍、回收率、檢測限及定量限及耐用性等試驗考察，該方法可行。首次對左卡尼汀片中的雜質右旋卡尼汀含量測定進行了方法確立與可行性研究。

采用柱前衍生法在phenomenex LUX Cellulose-1手性色譜柱上進行分析，建立測定L-肉堿中D-肉堿含量的測定方法。該手性高效液相色譜法分離與分析對映異構體具有快速、簡單、高靈敏度等特點，對L-肉堿、D-肉堿具有良好的分離與分析效果，可用于L-肉堿類原料藥、保健品等樣品中D-肉堿的含量檢測。

本研究在參考國內外文獻的基礎上[18]，改進了檢測方法，肉堿對映體化學反應主要發(fā)生在酯鍵或羥基，手性試劑常與肉堿結構中的羥基反應。采用衍生化方法用手性色譜柱分離左卡尼汀手性雜質。該技術與衍生后用HPLC分析相比較，克服了實驗過程復雜、重復性差的缺點。

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