王碩 謝惠敏 甘少磊 任衛(wèi)衛(wèi) 陳秉耀 張增亮 韋興

我國人口眾多，由于各種原因，如創(chuàng)傷、腫瘤、先天因素等導致的大塊骨缺損，影響著人們的基本生活及美觀。在臨床工作中，自體骨移植材料以幾乎零成本、高效的骨誘導、骨傳導及成骨能力，成為優(yōu)選材料。然而由于它固有的缺點：供區(qū)有限、供區(qū)并發(fā)癥等問題明顯[1-2]，人們一直在尋找一種能替代自體骨植骨材料的人工材料。但是很多骨科移植物都缺乏內(nèi)在的骨誘導性能，從而不能刺激未分化的多能干細胞向成骨細胞方向發(fā)展。骨形態(tài)發(fā)生蛋白 ( bone morphogenetic proteins，BMP )的出現(xiàn)彌補了這一點，它成為了最廣泛的骨形成調控因子[3]。美國食品和藥物管理局 ( Food and drug administration，F(xiàn)DA ) 已批準進入臨床的 BMP 類產(chǎn)品有 InFUSE Bone Graft ( rhBMP-2 與牛 1 型膠原復合 )和 OP.1 Putty ( rhBMP-7 與牛膠原復合 )，它們的臨床應用結果表明，具有很好的促進成骨作用[4]。

然而，它們由于制備工藝復雜、生產(chǎn)周期長、產(chǎn)率低、價格昂貴等現(xiàn)實問題不能被中國大多數(shù)患者所接受[5]。本課題組利用 BMP-2 氨基酸序列中誘導成骨的核心功能區(qū)，應用固相多肽合成法合成不同組合的 BMPs 序列多肽，該多肽保留了 BMP-2 的骨誘導能力，且無免疫原性等優(yōu)點，該方法具備合成費用低的特點。本研究擬通過 SD 大鼠異位成骨實驗進一步驗證哪種組合的 BMPs 序列多肽具有較好的誘導成骨作用，為該材料的臨床應用，提供實驗基礎。

材料與方法

一、材料

1. 實驗動物及實驗材料制備：SD 大鼠，雄性，8 周齡，200～250 g / 只，共 48 只，由解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院實驗動物中心提供。

制備好的框架材料羥基磷灰石聚乳酸 ( hydroxyapatite and poly lactic acid，HA / PLA ) 參數(shù)如下：空隙率 80%，平均孔徑 120 m，表觀密度 0.74 g / cm，壓縮強度 1 MPa。無菌條件下將框架材料切成直徑4 mm / 厚約 1.5 mm 的圓片，用60Co照射 ( 2.5 Mrad )消毒。并將 BMP 活性多肽用雙蒸水溶解，將消毒后的材料浸泡在多肽溶液中 18 h，待多肽溶液完全進入材料后取出密封，置于 4 ℃ 保存。本次實驗擬對 BMPIII 與 BMPIV 兩種 BMP 活性多肽復合HA / PLA 進行檢側，并將每種材料復合多肽的劑量分為 3 種，分別 0.2 g / L、0.4 g / L、0.8 g / L。實驗材料由北京博恩康生物科技有限公司提供，應用固相法合成。

多肽序列：BMPI：KIPKASSVPTEL，專利號 2014101217256；BMPIII：SVPTELSAISTLYL、BMPIV：KIPKASSVPTELSAISTL，專利號：2014101224353。

2. 主要試劑：戊巴比妥鈉購自美國 Sigma 公司；伊紅購自北京化學試劑公司；蘇木素購自北京化學試劑公司；改良 Masson 三色染色試劑盒購自Leagene 公司。

3. 主要設備：手術器械購自江蘇三興醫(yī)療器械公司；顯微鏡及碼成像系統(tǒng) ( Olympus BX50、DP50 )。

二、方法

1. 實驗動物分組及手術方法：應用隨機抽簽法將 48 只 SD 大鼠隨機分為 8 組 ( A、B、C、D、E、F、G、H 組 )，每組 6 只。8 周齡，200～250 g /只：將 BMPIII 多肽的 3 種濃度 0.2 g / L、0.4 g / L、0.8 g / L 的分別與 HA / PLA 組成的復合材料植入大鼠體內(nèi)，分別為 A、B、C 組；將 BMPIV 多肽的 3 種濃度 0.2 g / L、0.4 g / L、0.8 g / L 分別與 HA / PLA 復合植入大鼠體內(nèi)，分別為 D、E、F 組；植入 0.4 g / L濃度 BMPI 多肽與 HA / PLA 組成的復合材料的實驗對照為 G 組，僅植入 HA / PLA 框架材料的空白對照為 H 組。

用與 SD 大鼠質量百分比為 3% 的戊巴比妥鈉溶液靜脈麻醉后，無菌操作下，充分暴露兩側臀部肌肉，用手術刀切開臀部肌肉淺層，將材料放入并用不可吸收絲線將傷口縫合。按照實驗分組，術后自由活動，分籠飼養(yǎng)。

2. 觀察指標：( 1 ) 觀察術后 SD 大鼠活動、進食、傷口愈合等一般情況。( 2 ) 術后 3、5 周時分別對各組隨機選取 3 只大鼠麻醉進行影像學檢查，并于檢測后在麻醉狀態(tài)下注入空氣處死并提取材料標本。術后 3 周攝背部正位 X 線片；術后 5 周時進行 X 線、CT 照射。( 3 ) 將各組不同時間段的取材標本用 10% 甲醛溶液固定 24 h，硝酸脫鈣 12 h 后，常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)切片、HE 染色后在光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)。( 4 ) Masson 染色組織學觀察新生骨膠原形成 ( 藍色 ) 并計算新生骨面積[6]。由于Masson 染色對新生骨基質、植入材料及周圍正常組織顯色層次感明顯，可以顯著區(qū)分膠原和其余組織，故應用 Masson 染色對材料組織進行數(shù)據(jù)分析，以明確材料周圍軟骨基質分泌及成骨情況[6-7]。應用電子顯微鏡在每個標本材料區(qū)域內(nèi)隨機提取 3 個視野 ( ×400 )，計算成骨 ( 膠原 ) 面積。采用 Masson染色成骨面積評分系統(tǒng)進一步對各組在成骨膠原分泌旺盛時 ( 術后 5 周 ) 骨誘導活性進行組織學評分，并將其評分結果進行秩和平均等級兩兩比較[8]。未見膠原組織為 0 分，～25% 為 1 分，～50% 為2 分，～75% 為 3 分，～100% 為 4 分，統(tǒng)計并得出結果。

三、統(tǒng)計學處理

應用 SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。多組數(shù)據(jù)之間比較采用等級資料的秩和檢驗分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、實驗動物一般情況及大體觀察

所有動物均順利完成手術。術后觀察期間，動物飲食、活動良好，各組實驗動物傷口無腫脹、無膿性滲出、愈合良好，動物全部存活。植入材料各組硬度均增加。

二、X 線及 CT 成像觀察結果

X 線檢查：術后 3 周，手術植入?yún)^(qū) A、B、D、E、G 組均有輕度模糊顯影，C、F 組顯影明顯，H 組未見明顯顯影；術后 5 周，A、D 組植入?yún)^(qū)內(nèi)有較淺顯影，B、E、G 組有較淺較大顯影，C、F 組顯影較明顯，H 組未見明顯顯影 ( 圖 1～3 )。

圖1 a～c：分別為 A、B、C 組術后 3 周的 X 線顯像；d～f：分別為 A、B、C 組術后 5 周的 X 線顯像 (顯示可疑或可見材料成骨 )圖2 a～c：分別為 D、E、F 組術后 3 周的 X 線顯像；d～f：分別為 D、E、F 組術后 5 周的 X 線顯像 (顯示可疑或可見材料成骨 )圖3 a：為 G 組術后 3 周 X 線顯像；b：為 G 組術后 5 周 X 線顯像；c：為 H 組術后 5 周 X 線顯像；d：為 H 組術后 3 周 X 線顯像(顯示可疑或可見材料成骨 )Fig.1 a-c: The X-ray films at 3 weeks after the operation in group A, B and C; d-f: The X-ray films at 5 weeks after the operation in group A, B and C. The suspicious or visible osteogenesis material was showed by theFig.2 a-c: The X-ray films at 3 weeks after the operation in group D, E and F; d-f: The X-ray films at 5 weeks after the operation in group D, E and F. The suspicious or visible osteogenesis material was showed by theFig.3 a: The X-ray film at 3 weeks after the operation in group G; b: The X-ray film at 5 weeks after the operation in group G; c: The X-ray film at 5 weeks after the operation in group H; d: The X-ray film at 3 weeks after the operation in group H. The suspicious or visible osteogenesis material was showed by the

CT 顯示：除 A、D 組可見較模糊低密度顯影外，B、C、E、F、G 組均顯影明顯，H 組未見顯影。為排除框架材料 HA / PLA 未分解的材料對影像學影響，將框架材料在體外與大鼠尾骨做對比進行CT 照射，骨窗下僅見極低密度顯影 ( 圖 4～5 )。

三、組織學切片觀察結果

1. HE 染色：A、B、C、D、E 及 F 組術后 3 周可見少量成骨細胞長入多孔材料，貼附于孔壁；隨著植入時間的延長，材料周圍軟骨細胞活躍，材料逐漸降解，術后 5 周材料部分降解，其中 B、C 組有較多軟骨基質形成，D、E、F 組分泌軟骨基質情況與相對應的 A、B、C 組大致相同。G 組術后 5 周材料也降解，軟骨基質形成較多，有較多軟骨細胞形成；H 組框架材料分解較少，軟骨基質形成極少( 圖 6～8 )。

2. Masson 染色及術后 5 周成骨量評分比較：術后 3 周，A、D 組在降解材料周圍僅有少量軟骨膠原形成表現(xiàn)為藍色，且 B、C 組和 E、F 組軟骨膠原量分別明顯多于 A 組和 D 組，表現(xiàn)為藍色，可見少許紅染。G 組術后 3 周藍色面積較小，而 H 組降解材料周圍軟骨膠原極少。術后 5 周，A、B、C、D、E 及 F 組藍色面積明顯多于術后 3 周，周圍少量紅染，G 組藍色面明顯增大，而 H 組降解材料周圍軟骨膠原較少，僅見少量藍色軟骨膠原形成( 圖 9～11 )。

成軟骨膠原面積的 Masson 評分：B 組 ( 2.22±0.45 ) 分、C 組 ( 2.44±0.35 ) 分明顯大于 A 組 ( 1.06±0.39 ) 分，E 組 ( 2.28±0.25 ) 分、F 組 ( 2.44±0.35 ) 分明顯大于 D 組 ( 0.72±0.25 ) 分，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05 )；A 組與 D 組的評分相差不大 (P＞0.05 )，而 E、F 組評分均明顯大于 A 組，B、C 組評分均明顯大于 D 組，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05 )；B、C、E、F 組各組間評分兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05 )；G 組評分 ( 2.67±0.30 ) 分較 B、E 組大，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05 )，而與 C、F 組評分相差不大 (P＞0.05 )。H 組評分最少，為 ( 0.222±0.27 ) 分，除 D 組外，與其它各組差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05 )。

圖4 a～c：為 A、B、C 組術后 5 周的 CT 顯像；d～f：為D、E、F 組術后 5 周的 CT 顯像(顯示可疑或可見材料成骨 )圖 5 a：為框架材料 HA / PLA在體外以鼠尾為對照的 CT 橫斷面顯像；b：為 G 組術后 5 周的CT 顯像；c：為 H 組術后 5 周的 CT 顯像 (顯示可疑或可見材料成骨 )Fig.4 a-c: The CT images at 5 weeks after the operation in group A, B and C; d-f: The CT images at 5 weeks after the operation in group D, E and F. The suspicious or visible osteogenesis material was showed by theFig.5 a: The framework materials HA / PLA were showed in the rat tail in vitro on CT; b:The CT image at 5 weeks after the operation in group G; c:The CT image at 5 weeks after the operation in group H. The suspicious or visible osteogenesis material was showed by the

圖6 a～c：分別為術后 3 周 A、B、C 組的 HE 染色；d～f：分別為術后 5 周 A、B、C 組的 HE 染色 (為框架材料， 為軟骨基質。圖片均為光鏡下 × 400，右下角比例尺長度 = 100 μm )圖 7 a～c：分別為術后 3 周 D、E、F 組的 HE 染色；d～f：分別為術后 5 周 D、E、F 組的 HE 染色 (為框架材料， 為軟骨基質。圖片均為光鏡下 × 400，右下角比例尺長度 = 100 μm )Fig.6 a-c: The HE staining at 3 weeks after the operation in group A, B and C; d-f: The HE staining at 5 weeks after the operation in group A, B and C. The framework material was marked by theand cartilage matrix was marked by the. Images were observed under the light microscope( ×400 ), and scale bar=100 μmFig.7 a-c: The HE staining at 3 weeks after the operation in group D, E and F; d-f: The HE staining at 5 weeks after the operation in group D, E and F. The framework material was marked by theand cartilage matrix was marked by the. Images were observed under the light microscope( ×400 ), and scale bar=100 μm

圖 8 a：為術后 3 周 G 組的 HE 染色；b：為術后 5 周 G 組的 HE 染色；c：為術后 5 周 H 組的 HE 染色；d：為 H 組術后 3 周 HE 染色(為框架材料， 為軟骨基質。圖片均為光鏡下 × 400，右下角比例尺長度 = 100 μm )圖 9 a～c：分別為術后 3 周 A、B、C 組的 Masson 染色；d～f：分別為術后 5 周 A、B、C 組的 Masson 染色 (為框架材料， 為軟骨基質。圖片均為光鏡下 × 400，右下角比例尺長度 = 100 μm )圖 10 a～c：分別為術后 3 周 D、E、F 組的 Masson 染色；d～f：分別為術后 5 周 D、E、F 組 Masson 染色 (為框架材料， 為軟骨基質。圖片均為光鏡下 × 400，右下角比例尺長度 = 100 μm )圖 11 a：為術后 3 周 G 組 Masson 染色；b：為術后 5 周 G 組 Masson 染色；c：為術后 5 周 H 組 Masson 染色；d：為 H 組術后 3 周Masson 染色 (為框架材料， 為軟骨基質。圖片均為光鏡下 × 400，右下角比例尺長度 = 100 μm )Fig.8 a: The HE staining at 3 weeks after the operation in group G; b: The HE staining at 5 weeks after the operation in group G; c: The HE staining at 5 weeks after the operation in group H; d: The HE staining at 3 weeks after the operation in group H. The framework material was marked by theand cartilage matrix was marked by the. Images were observed under the light microscope ( ×400 ), and scale bar=100 μmFig.9 a-c: The Masson staining at 3 weeks after the operation in group A, B and C; d-f: The Masson staining at 5 weeks after the operation in group A, B and C. The framework material was marked by theand cartilage matrix was marked by the. Images were observed under the light microscope ( ×400 ), and scale bar=100 μmFig.10 a-c: The Masson staining at 3 weeks after the operation in group D, E and F; d-f: The Masson staining at 5 weeks after the operation in group D, E and F. The framework material was marked by theand cartilage matrix was marked by the. Images were observed under the light microscope ( ×400 ), and scale bar=100 μmFig.11 a: The Masson staining at 3 weeks after the operation in group G; b: The Masson staining at 5 weeks after the operation in group G; c:The Masson staining at 5 weeks after the operation in group H; d: The Masson staining at 3 weeks after the operation in group H. The framework material was marked by theand cartilage matrix was marked by the. Images were observed under the light microscope ( ×400 ), and scale bar=100 μm

討 論

一、BMP 多肽活性

骨形成發(fā)生蛋白 ( BMPs ) 是一組具有類似結構的高度保守的功能蛋白，屬于轉化生長因子 B 超家族成員，是一種多功能的細胞生長因子，能夠在體內(nèi)外誘導骨和軟骨形成，是目前骨移植材料中，效果較理想的材料[9]。自 Urist 于 1965 年發(fā)現(xiàn)BMPs[10]，BMPs 已經(jīng)被逐漸認識，并應用重組技術大量用于生產(chǎn)，rhBMP-2 與 rhBMP-7 是現(xiàn)在兩個僅有的應用于國外臨床的材料[11-12]。這兩個材料已經(jīng)過動物實驗及臨床實驗，證明了它們有效的骨誘導活性，成為可以替代自體骨的移植材料[13]。盡管這兩種材料有強大的骨誘導能力，但由于其制備工藝復雜、生產(chǎn)周期長、產(chǎn)率低、價格昂貴及術后局部炎性反應等問題，阻礙了其在臨床的迅速發(fā)展[14-16]。根據(jù) BMP-2 氨基酸序列中 II 型受體具有很多抗原表位，其特征性的“指節(jié)抗原表位”具有誘導成骨的核心功能區(qū)段 ( 20 個氨基酸 )[17]，通過 FMOC 固相多肽合成法合成含 20 多個氨基酸的寡肽－BMP 活性多肽 ( BMPI、BMPIII、BMPIV )，以便能夠模擬天然骨基質的促發(fā)及指導生物礦化，在局部形成偏酸環(huán)境，促進局部鈣磷自組裝沉積到體內(nèi)局部組織中膠原纖維表面，生長成按同一方向排列的堅硬羥基磷灰石微型晶體結構，形成與天然骨極為相似的結構。

固相合成的優(yōu)點主要表現(xiàn)在，最初的反應物和產(chǎn)物都是連接在固相載體上，因此可以在一個反應容器中進行所有的反應，便于自動化操作，加入過量的反應物可以獲得高產(chǎn)率的產(chǎn)物，同時產(chǎn)物很容易分離，能夠有效克服用基因工程技術制備大分子蛋白質時工藝復雜、成本高、價格昂貴的缺點；而且活性多肽可發(fā)揮與其蛋白質類似的作用，同時短鏈多肽活性位點能充分暴露并與細胞表面相應的受體結合，達到較好的生物活性。Saito 等曾將 BMP-2核心區(qū)的 20 個氨基酸復合藻酸鹽水凝膠進行異位成骨實驗，發(fā)現(xiàn)其效果不如 BMP-2，但優(yōu)于對照組，在后期實驗中對多肽進行改進，可于 12 周完成骨缺損修復[18-19]。Park 等[20]用包含促成骨活性區(qū)域 ( osteopromotive domain，OPD ) 的“DWIVA”序列的具有受體結合能力的 BMP-2 肽段進行骨缺損實驗，在 4 周時有明顯的骨質生長。Zhao 等[21]利用 BMP-2 多肽復合可注射水凝膠植入大鼠背部肌肉，注射后 6 周 HE 染色可見骨小梁形成，也證明BMP-2 多肽有骨誘導能力。

二、BMP 多肽實驗結果分析

本課題組以往相關研究證實了，BMP-2 活性多肽具有體外定向誘導大鼠 BMSCs 向成骨方向分化的作用[22]。BMP 活性多肽與 BMP 一樣具有生物學活性，有優(yōu)秀的骨誘導能力[23]，但 BMP 活性多肽缺乏力學強度，且難于塑形。由于 HA / PLA 作為易于塑形且具有適當?shù)牧W性能，而缺乏骨誘導活性的材料。因此，將二者結合，希望能達到理想的植骨材料水平。為了評價 BMP-2 活性多肽復合 HA / PLA框架架材料在體內(nèi)的活性，本研究根據(jù)在核心功能區(qū)兩側添加的氨基酸序列不同分為兩個實驗組，并與前期實驗結果提示的骨誘導能力較優(yōu)者 ( 0.4 g / L BMPI ) 進行對比，進行了異位成骨實驗，將負載了BMPIII、BMPIV 的 3 個濃度 0.2 g / L、0.4 g / L、0.8 g / L活性多肽的框架材料。結果顯示：術后 3 周，實驗組 0.8 g / L 濃度組可見片狀高密度影，而 0.2 g / L、0.4 g / L 濃度組可見輕微的點狀低密度影；術后 5 周，0.4 g / L、0.8 g / L 濃度組均有新骨形成，片狀高密度影明顯增強，接近正常骨組織密度，而 0.2 g / L 濃度組新骨形成量較小，點狀高密度影較淺。為排除框架材料 HA / PLA 對影像學影響，將框架材料在體外與大鼠尾骨做對比進行 CT 照射，骨窗下可見極低密度顯影，基本不影響材料在影像學的觀察。組織學觀察可見，G 組與實驗組 0.8 g / L 濃度組有大量骨膠原形成，可證明其骨組織增長旺盛。而實驗組的0.2 g / L、0.4 g / L 濃度組骨膠原可見梯度增加，這說明 BMPIII 與 BMPIV 材料在 0.2～0.4 g / L 范圍內(nèi)骨膠原分泌會隨濃度的增加而增加；而 0.4～0.8 g / L時，卻無明顯骨膠原分泌增加。以上研究結果表明，BMPIII 與 BMPIV 均有骨誘導活性，且兩者等濃度時骨誘導活性大致相等 (P＞0.05 )；G 與 C、F 組骨誘導能力大致相等 (P＞0.05 )，均強于 BMPIII、BMPIV 其它濃度 (P＜0.05 )，可以證明濃度為BMPIII 與 BMPIV 的 0.8 g / L 組更適于成為骨修復材料，而 G 組 ( BMPI 0.4 g / L ) 骨誘導能力又較 BMPIII與 BMPIV 更適于成為骨誘導材料。

三、實驗不足

本研究證明了術后 5 周各組有成骨，實驗多肽具有骨誘導能力，但其效果距離 InFUSE Bone Graft( rhBMP-2 與牛 1 型膠原復合 )、OP.1 Putty ( rhBMP-7與牛膠原復合 ) 仍有不小距離[17-18]。有文獻報道這些材料可以在術后 3～4 周局部有新生骨形成，本實驗證明人工多肽在術后 5 周還處于骨膠原大量分泌期，故仍須將材料進一步改良。骨誘導實驗只是材料動物實驗的一部分，仍須進一步行動物體內(nèi)骨缺損材料植入實驗來驗證其成骨能力、生物力學等性能。

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