鄭　穎，姜　凱(浙江省立同德醫(yī)院婦產(chǎn)科，檢驗(yàn)科，浙江杭州300)

歐前胡素增強(qiáng)多柔比星對(duì)HeLa細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)

鄭穎1△，姜?jiǎng)P2
(浙江省立同德醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2檢驗(yàn)科，浙江杭州310012)

［摘要］目的:研究歐前胡素是否能提高宮頸癌HeLa細(xì)胞株對(duì)多柔比星的敏感性。方法: MTT法檢測(cè)HeLa細(xì)胞用歐前胡素和多柔比星處理后的活力。Western blot檢測(cè)HeLa細(xì)胞用歐前胡素和多柔比星處理后Bcl-2蛋白家族成員(Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL、Bad和Bax)的表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HeLa細(xì)胞用歐前胡素和多柔比星處理后的凋亡水平和線粒體膜電位的變化情況。構(gòu)建Mcl-1真核表達(dá)載體，MTT法檢測(cè)Mcl-1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對(duì)歐前胡素聯(lián)合多柔比星治療宮頸癌效果的影響。結(jié)果:歐前胡素在體外可顯著提高多柔比星對(duì)宮頸癌細(xì)胞系HeLa的殺傷活性。歐前胡素可顯著降低HeLa細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)，而多柔比星對(duì)Mcl-1的表達(dá)水平無影響。相比于歐前胡素或多柔比星單治療組，兩者聯(lián)合可顯著誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡并降低其線粒體膜電位。體外轉(zhuǎn)染Mcl-1真核表達(dá)載體顯著降低多柔比星聯(lián)合歐前胡素對(duì)HeLa細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)論:歐前胡素通過靶向于Mcl-1增強(qiáng)多柔比星對(duì)宮頸癌細(xì)胞的殺傷活性。

［關(guān)鍵詞］歐前胡素;多柔比星; Mcl-1;宮頸癌

1000-4718(2015) 09-1578-06

［修回日期］2015-06-05

宮頸癌是全球發(fā)病率第2位的婦科腫瘤，每年有超過50萬患者被診斷為宮頸癌，好發(fā)于40歲以上女性，手術(shù)和化療目前仍是治療宮頸癌的主要手段［1］。多柔比星是目前最主要的抗腫瘤藥物之一，能有效治療肺癌、宮頸癌、前列腺癌等［2-3］。以多柔比星為主的化療方案在腫瘤治療中越來越被重視，然而隨著多柔比星的反復(fù)使用，腫瘤細(xì)胞將逐漸對(duì)其產(chǎn)生耐藥，且藥物的心臟毒性也漸漸凸顯，因此目前亟待解決的問題就是如何選用最佳的輔助藥物以取得最好的療效并降低多柔比星的耐藥性［4］。歐前胡素是一種呋喃香豆素類化合物，是從中藥白芷中提取的主要活性成分［5］?，F(xiàn)在臨床上主要用于抗炎癥、抗凝血、抑制心肌肥厚等［6-7］。最近有文獻(xiàn)報(bào)道歐前胡素還有一定的抗腫瘤作用，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，阻礙其細(xì)胞周期，甚至可直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［8-9］。然而歐前胡素單獨(dú)用藥的療效并不十分理想［10］。因此本文的目的在于研究中藥歐前胡素是否能提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)材料

多柔比星、歐前胡素、MTT和Annexin V凋亡試劑盒購于Sigma; DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco;細(xì)胞蛋白提取液購于江蘇碧云天;人Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL、Bad、Bax及β-actin多克隆抗體購于CST; TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pcDNA3.1、Lipofectamine 2000購于Invitrogen; SYBR Green試劑購于日本TaKaRa; ECL試劑盒購于Pierce; 5，5’，6，6’-四氯-1，1’，3，3’-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物(JC-1)購于Molecular Probes。各PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞系HeLa購于ATCC。HeLa細(xì)胞系培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通入5% CO2。

2.2MTT法檢測(cè)HeLa的細(xì)胞活力及多柔比星對(duì)HeLa的半數(shù)抑制濃度(IC50)將HeLa細(xì)胞按每孔5×103接種在96孔板上孵育12 h。之后將歐前胡素和多柔比星加入培養(yǎng)體系中孵育48 h。加入20 mL MTT (5 g/L)培養(yǎng)4 h，移除孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO，振蕩后在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)。相對(duì)細(xì)胞活力用實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的A值的比值表示。IC50根據(jù)多柔比星濃度與相對(duì)細(xì)胞活力曲線確定。

2.3Real-time PCR檢測(cè)Mcl-1的表達(dá)宮頸癌細(xì)胞系HeLa總RNA用TRIzol試劑提取。cDNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按操作說明步驟由總RNA合成。Mcl-1的定量PCR擴(kuò)增使用SYBR Green試劑，GAPDH作為內(nèi)參照，Mcl-1的相對(duì)表達(dá)由2－ΔΔCt法計(jì)算［11］。Mcl-1的上游引物為5’-TGGCTAAACACTTGAAGACC-3’，下游引物為5’-GGAAGAACTCCACAAACCC-3’; GAPDH的上游引物為5’-CCACTCCTCCACCTTTG-3’，下游引物為5’-CACCACCCTGTTGCTGT-3’。

2.4Western blot實(shí)驗(yàn)藥物處理后，收集HeLa細(xì)胞，用蛋白裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，提取總蛋白質(zhì)。將蛋白提取液用12.5%的SDS-PAGE進(jìn)行分離，將電泳分離膠通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL、Bad、Bax或β-actin多克隆抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的II抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

2.5HeLa細(xì)胞凋亡的檢測(cè)將HeLa細(xì)胞用歐前胡素和多柔比星處理24 h，收集細(xì)胞，按照凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作步驟將細(xì)胞用Annexin V和碘化丙啶(PI)室溫孵育15 min，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.6線粒體膜電位(ΔΨm)的檢測(cè)將HeLa細(xì)胞接種在6孔板中孵育12 h。換新鮮培養(yǎng)基后加入歐前胡素和多柔比星繼續(xù)處理HeLa細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，加入5 μmol/L JC-1 37℃孵育20 min，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位。正常細(xì)胞發(fā)生紅色熒光，膜電位越低，紅色熒光越弱［12］。

2.7質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染以HeLa細(xì)胞的cDNA為模板，將Mcl-1的開放閱讀框架以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成pcDNA3.1-Mcl-1重組真核表達(dá)質(zhì)粒［13］。待HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)到鋪滿培養(yǎng)瓶約80%密度后，將pcDNA3.1-Mcl-1質(zhì)粒(2 mg/L)用Lipofectamine 2000試劑按照試劑說明書步驟轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞中。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用非配對(duì)雙側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

結(jié)果

1歐前胡素增強(qiáng)多柔比星對(duì)HeLa細(xì)胞的殺傷活性

歐前胡素單獨(dú)作用對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用不強(qiáng)，歐前胡素需超過80 μmol/L時(shí)才能顯著抑制He-La細(xì)胞的細(xì)胞活力(圖1)。選擇低濃度10 μmol/L歐前胡素與多柔比星一起聯(lián)合治療HeLa細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度的歐前胡素可顯著提高多柔比星對(duì)He-La細(xì)胞的殺傷活性并顯著降低HeLa細(xì)胞對(duì)多柔比星的IC50(圖2)。

2歐前胡素抑制HeLa細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)

歐前胡素(10 μmol/L)可顯著降低HeLa細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)，但對(duì)其它Bcl-2家族蛋白(Bcl-2、BclxL、Bad和Bax)無影響，多柔比星(4 μmol/L)對(duì)He-La細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)亦無影響(圖3)。

3歐前胡素增強(qiáng)多柔比星對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)

Figure 1.The relative viability of HeLa cells treated with various concentrations of imperatorin.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.圖1不同濃度歐前胡素對(duì)HeLa細(xì)胞活力的影響

低濃度的歐前胡素(10 μmol/L)和多柔比星(4 μmol/L)單治療組HeLa細(xì)胞的凋亡水平差異不顯著。然而將兩者聯(lián)合使用后，對(duì)HeLa細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)顯著提升(圖4)，表明歐前胡素和多柔比星存在藥物協(xié)同效應(yīng)。

4歐前胡素促進(jìn)多柔比星的抗腫瘤效應(yīng)是通過下調(diào)Mcl-1起作用

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源性Mcl-1的強(qiáng)制表達(dá)可顯著抑制歐前胡素(10 μmol/L)對(duì)多柔比星(4 μmol/L)的協(xié)同效應(yīng)(圖5)。另外，相比于歐前胡素(10 μmol/L)和多柔比星(4 μmol/L)單治療組，兩者聯(lián)合能顯著誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞線粒體膜電位的下降，而外源性Mcl-1可阻止ΔΨm的降低(圖6)。

討論

Figure 2.Imperatorin enhanced the cytotoxicity of doxorubicin to HeLa cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs doxorubicin group.圖2歐前胡素增強(qiáng)多柔比星對(duì)HeLa細(xì)胞的殺傷活性

Figure 3.Imperatorin down-regulated the expression of Mcl-1 in the HeLa cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs doxorubicin group.圖3歐前胡素下調(diào)HeLa細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)水平

Figure 4.Imperatorin increased the apoptotic rate of HeLa cells induced by doxorubicin.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs doxorubicin group.圖4歐前胡素增強(qiáng)多柔比星對(duì)HeLa細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)

盡管多柔比星是目前治療腫瘤的一線化療藥物，然而在經(jīng)過重復(fù)用藥后，腫瘤細(xì)胞往往通過減少多柔比星的轉(zhuǎn)運(yùn)攝取、增加DNA修復(fù)能力、降低凋亡率等機(jī)制產(chǎn)生對(duì)多柔比星的耐藥性［14-15］。為了克服這一局限性，在進(jìn)行多柔比星化療的基礎(chǔ)上，再聯(lián)合另外一種藥物以減弱腫瘤細(xì)胞對(duì)多柔比星的耐藥顯得十分重要。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)雖然低劑量歐前胡素的直接抗宮頸癌作用比較弱，但卻可顯著提升一線化療藥物多柔比星對(duì)HeLa的殺傷活性，表明中藥歐前胡素可與多柔比星發(fā)揮協(xié)同治療作用。

Bcl-2蛋白家族包括促凋亡成員和抗凋亡蛋白成員(如Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL、Bad和Bax等)，這些蛋白的相對(duì)表達(dá)水平?jīng)Q定了細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序［16］。Mcl-1是Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白成員，包含3個(gè)BH(Bcl-2 homology)位點(diǎn)。Mcl-1蛋白定位于細(xì)胞線粒體膜上，通過與促凋亡蛋白Noxa、Puma、Bim、Bid等結(jié)合，使它們失活從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用［17］。因此，Mcl-1的過表達(dá)有助于保護(hù)細(xì)胞逃避凋亡信號(hào)，包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤，其Mcl-1的表達(dá)水平均顯著上調(diào)［18］。Wei等［19］發(fā)現(xiàn)敲除Mcl-1基因后，胰腺癌細(xì)胞可發(fā)生自發(fā)性凋亡，且其對(duì)化療藥物吉西他濱的敏感性顯著增強(qiáng)，可見由于Mcl-1的抗凋亡作用，高表達(dá)的Mcl-1成為腫瘤細(xì)胞抵抗化療藥物殺傷活性的重要機(jī)制［20］，Mcl-1基因已經(jīng)成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

Figure 5.Imperatorin enhanced the cytotoxicity of doxorubicin to HeLa cells via down-regulating Mcl-1 expression，and this effect was inhibited by the transfection of pcDNA3.1-Mcl-1 plasmid.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs pc-DNA3.1-empty.圖5歐前胡素通過下調(diào)Mcl-1的表達(dá)增強(qiáng)多柔比星對(duì)He-La細(xì)胞的殺傷活性

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)歐前胡素能顯著降低He-La細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)水平，而多柔比星對(duì)Mcl-1基因的表達(dá)無影響，因此我們推測(cè)歐前胡素增強(qiáng)多柔比星抗宮頸癌活性的機(jī)制可能和Mcl-1有關(guān)。為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，我們將外源性Mcl-1通過質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞中強(qiáng)制高表達(dá)，之后發(fā)現(xiàn)歐前胡素對(duì)多柔比星的協(xié)同抗腫瘤作用喪失，證實(shí)了歐前胡素增強(qiáng)多柔比星抗腫瘤活性的機(jī)制可能和下調(diào)Mcl-1表達(dá)水平有關(guān)。由于Mcl-1的表達(dá)水平和凋亡密切相關(guān)，而凋亡的誘導(dǎo)往往和線粒體的失能有關(guān)［21］。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)歐前胡素聯(lián)合多柔比星能顯著降低HeLa細(xì)胞的線粒體膜電位，提示歐前胡素促進(jìn)多柔比星引起的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的機(jī)制可能是通過下調(diào)宮頸癌細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)，進(jìn)而引起線粒體膜電位喪失，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡。綜上所述，歐前胡素-Mcl-1-線粒體途徑與多柔比星的抗宮頸癌活性密切相關(guān)，它可能成為腫瘤化療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

Figure 6.Doxorubicin plus imperatorin significantly decreased the ΔΨmin the HeLa cells，and this effect was inhibited by the transfection of pcDNA3.1-Mcl-1 plasmid.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs doxorubicin+ imperatorin group.圖6多柔比星聯(lián)合歐前胡素顯著降低HeLa細(xì)胞的線粒體膜電位

［參考文獻(xiàn)］

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013［J］.CA Cancer J Clin，2013，63(1) : 11-30.

［2］Orzechowska EJ，Girstun A，Staron K，et al.Synergy of BID with doxorubicin in the killing of cancer cells［J］.Oncol Rep，2015，33(5) : 2143-2150.

［3］曾小平，王紅梅，黃永紅，等.阿霉素聯(lián)合致敏樹突狀細(xì)胞對(duì)荷宮頸癌小鼠的治療作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2013，29(4) : 734-738.

［4］Wang Z，Yang L，Xia Y，et al.Icariin enhances cytotoxicity of doxorubicin in human multidrug-resistant osteosarcoma cells by inhibition of ABCB1 and down-regulation of the PI3K/Akt pathway［J］.Biol Pharm Bull，2015，38 (2) : 277-284.

［5］Appendino G，Bianchi F，Bader A，et al.Coumarins from Opopanax chironium.New dihydrofuranocoumarins and differential induction of apoptosis by imperatorin and heraclenin［J］.J Nat Prod，2004，67(4) : 532-536.

［6］García-Argáez AN，Ramírez Apan TO，Parra Delgado H，et al.Anti-inflammatory activity of coumarins from Decatropis bicolor on TPA ear mice model［J］.Planta Med，2000，66(3) : 279-281.

［7］Zhang Y，Cao Y，Zhang Y，et al.Furanocoumarins-imperatorin inhibits myocardial hypertrophy both in vitro and in vivo［J］.Fitoterapia，2010，81(8) : 1188-1195.

［8］Choochuay K，Chunhacha P，Pongrakhananon V，et al.Imperatorin sensitizes anoikis and inhibits anchorage-independent growth of lung cancer cells［J］.J Nat Med，2013，67(3) : 599-606.

［9］Luo KW，Sun JG，Chan JY，et al.Anticancer effects of imperatorin isolated from Angelica dahurica: induction of apoptosis in HepG2 cells through both death-receptor-and mitochondria-mediated pathways［J］.Chemotherapy，2011，57(6) : 449-459.

［11］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2－ΔΔCtmethod［J］.Methods，2001，25(4) : 402-408.

［12］Prathapan A，Vineetha VP，Raghu KG.Protective effect of Boerhaavia diffusa L against mitochondrial dysfunction in angiotensin II induced hypertrophy in H9c2 cardiomyoblast cells［J］.PLoS One，2014，9(4) : e96220.

［13］Sun JG，Xiang J，Zeng XL，et al.Clitocine induces apoptosis and enhances the lethality of ABT-737 in human colon cancer cells by disrupting the interaction of Mcl-1 and Bak［J］.Cancer Lett，2014，355(2) : 253-263.

［14］Wang T，Huang B，Lei X，et al.A let-7b binding site SNP in the 3’-UTR of the Bcl-xL gene enhances resistance to 5-fluorouracil and doxorubicin in breast cancer cells ［J］.Oncol Lett，2015，9(4) : 1907-1911.

［15］Kang Q，Yan S.Piperlongumine reverses doxorubicin resistance through the PI3K/Akt signaling pathway in K562/A02 human leukemia cells［J］.Exp Ther Med，2015，9 (4) : 1345-1350.

［16］Zhao J，Li X，Zou M，et al.miR-135a inhibition protects A549 cells from LPS-induced apoptosis by targeting Bcl-2 ［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，452 (4) : 951-957.

［17］Thomas LW，Lam C，Edwards SW.Mcl-1: the molecular regulation of protein function［J］.FEBS Lett，2010，584 (14) : 2981-2989.

［18］Pignochino Y，Grignani G，Cavalloni G，et al.Sorafenib blocks tumour growth，angiogenesis and metastatic potential in preclinical models of cervical cancer through a mechanism potentially involving the inhibition of ERK1/2，MCL-1 and ezrin pathways［J］.Mol Cancer，2009，8: 118.

［19］Wei SH，Dong K，Lin F，et al.Inducing apoptosis and enhancing chemosensitivity to gemcitabine via RNA interference targeting Mcl-1 gene in pancreatic carcinoma cell ［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2008，62(6) : 1055-1064.

［20］Michels J，Obrist F，Vitale I，et al.MCL-1 dependency of cisplatin-resistant cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2014，92(1) : 55-61.

［21］Zhang XJ，Mei WL，Tan GH，et al.Strophalloside induces apoptosis of SGC-7901 cells through the mitochondrion-dependent caspase-3 pathway［J］.Molecules，2015，20(4) : 5714-5728.

(責(zé)任編輯:林白霜，羅森)

Antitumor effect of imperatorin enhances cytotoxicity of doxorubicin to HeLa cells

ZHENG Ying1，JIANG Kai2
(1Department of Obstetrics＆Gynaecology，2Department of Laboratory Medicine，Tongde Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou 310012，China.E-mail: tongdezhengying@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To determine whether imperatorin would enhance the effect of doxorubicin therapy on cervical cancer in vitro.METHODS: The viability of HeLa cells treated with imperatorin and doxorubicin was determined by MTT assay in vitro.The expression of Bcl-2 protein family (Mcl-1，Bcl-2，Bcl-xL，Bad and Bax) in HeLa cells treated with imperatorin and doxorubicin was evaluated by Western blot analysis.The apoptosis and mitochondrial membrane potential (ΔΨm) in the HeLa cells treated with imperatorin and doxorubicin were analyzed by flow cytometry.A Mcl-1 expression vector was constructed，and its role in the cytotoxicity of imperatorin plus doxorubicin to HeLa cells was detected by MTT assay.RESULTS: Addition of imperatorin significantly enhanced the cytotoxicity of doxorubicin to HeLa cells in vitro.Mcl-1 expression was down-regulated by imperatorin but was not influenced by doxorubicin in the HeLa cells.A combination of imperatorin and doxorubicin induced apoptosis and ΔΨmcollapse more significantly compared with the treatment with imperatorin or doxorubicin alone.Furthermore，the imperatorin-induced sensitization for doxorubicin cytotoxicity to HeLa cells was abolished by the transfection with Mcl-1 expression plasmid.CONCLUSION: The combination of doxorubicin with imperatorin enhances the antitumor effect of doxorubicin on cervical cancer cells via targeting Mcl-1.

［KEY WORDS］Imperatorin; Doxorubicin; Mcl-1; Cervical cancer

通訊作者△Tel: 0571-89972339; E-mail: tongdezhengying@163.com

［收稿日期］2015-04-13

［中圖分類號(hào)］R730.23; R735.7

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.008

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)09-1578-06