趙瑞芹 付海燕 張麗霞 徐梅先 王鳳英 殷春蘭 安會波

自1969 年美國首次報道EV71 感染性疾病后［1］，世界多數(shù)國家發(fā)生了暴發(fā)流行，在大流行時期，EV71感染患者出現(xiàn)了嚴(yán)重的并發(fā)癥及死亡病例。我國臺灣地區(qū)在1998 至2008 年發(fā)生3 次暴發(fā)流行，因EV71 感染致死病例約為250 例［2］。大陸地區(qū)安徽阜陽2008年出現(xiàn)暴發(fā)流行，20 余例患兒死亡，隨后全國各地報道了該病的流行。近年每年均有手足口病暴發(fā)流行，并出現(xiàn)不少重癥病例及死亡病例。手足口病成為我國兒童期死亡的重要原因之一。多數(shù)手足口病臨床表現(xiàn)輕，預(yù)后較好。而重癥手足口病病情進展極為迅速，部分患兒就診時即有嚴(yán)重的腦損傷，并迅速進展為肺出血、肺水腫導(dǎo)致死亡。挽救重癥患兒、降低死亡率的關(guān)鍵在于早期識別重癥患兒。隨著對手足口病的關(guān)注增加以及研究的進一步深入，國內(nèi)外學(xué)者分析總結(jié)了重癥手足口病患兒的高危因素，如年齡小于3 歲，持續(xù)發(fā)熱＞39℃，持續(xù)3 d 以上，血糖升高＞8.3 mmol/L，血常規(guī)白細(xì)胞＞17.5 ×109/L，肢體無力、心率增快等等［3－5］。文獻報道紅細(xì)胞免疫黏附功能、紅細(xì)胞CRl密度相關(guān)基因組多態(tài)性對腫瘤、糖尿病、腎病綜合征、嚴(yán)重膿毒癥，以及傳染性疾病如病毒性肝炎、嚴(yán)重急性呼吸綜合征等疾病具有臨床評估病情變化、療效觀察、判斷預(yù)后的重要指示意義［6，7］，其對手足口病的預(yù)警作用至今筆者尚未發(fā)現(xiàn)文獻報道。本研究通過探討紅細(xì)胞免疫黏附功能、CR1 基因多態(tài)性與手足口病的病情變化相聯(lián)系，通過對臨床病例的研究，建立有效的判斷預(yù)后指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2011 年4 月至2012 年2月期間我院住院手足口病患兒111 例?；純貉适米硬捎脤崟r熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測EV71，結(jié)果均為陽性?；加邢忍煨孕呐K病、免疫缺陷、腦癱等基礎(chǔ)疾病者，近期有麻疹、結(jié)核等傳染病史者及近期應(yīng)用免疫球蛋白者不納入本研究。根據(jù)《腸道病毒71 型(EV71)感染重癥病例臨床救治專家共識》［8］，將患兒分為3 組。

1.1.1 死亡組:患兒入院后迅速進展至心肺衰竭，經(jīng)積極救治無效死亡，共6 例。

1.1.2 危重組:患兒病程進展至手足口病心肺衰竭前期及心肺衰竭期，有心率、呼吸增快，出冷汗、皮膚花紋、四肢發(fā)涼，血壓升高，血糖升高，外周血白細(xì)胞(WBC)升高，病?；純撼霈F(xiàn)口唇紫紺、咳粉紅色泡沫痰或血性液體等表現(xiàn)，經(jīng)積極救治，患兒逐漸恢復(fù)，共57 例。

觀察組34例中，有效23例，部分有效8例，無效2例，復(fù)發(fā)1例，總有效率為91.18%；對照組34例中，有效12例，部分有效15例，無效5例，復(fù)發(fā)2例，總有效率為79.41%，觀察組明顯優(yōu)于對照組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

1.3.4 瓊脂糖電泳:取12 ～15 μl 酶切反應(yīng)液用2%瓊脂糖凝膠電泳。酶切后分3 種基因型。高表達(HH):只有與擴增物(1.8 kb)相同分子量一條帶的標(biāo)本;中表達(HL):有1.8 kb、1.3 kb 和0.5 kb 三條帶;低表達(LL):只有1.3 和0.5 kb 兩條帶。

1.2 方法 患兒入院次日晨留取靜脈血3 ml，枸櫞酸鈉抗凝，分別進行以下檢測。

1.2.1 紅細(xì)胞天然免疫粘附功能檢測

1.2.1.1 血標(biāo)本處理:將枸櫞酸鈉抗凝血2 ml 水平離心(2 000 r/min)，使紅細(xì)胞沉淀。

對照組接受常規(guī)護理，囑咐患者按時按量服藥，并基于患者的病情予以飲食指導(dǎo)，對患者日常生活進行精心照顧，預(yù)防產(chǎn)生各種意外事件的出現(xiàn)。

1)本自適應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的靜態(tài)仿真實驗表明，系統(tǒng)控制的相對誤差均在5%以內(nèi)，其中當(dāng)該系統(tǒng)工作在半量程區(qū)間時，有著較好的控制精度。

散會后，大家一起到二樓的餐廳聚餐。席間，齊眉給每人分發(fā)了一個紅包。高潮拿到紅包后，心里直癢癢，瞅個機會跑到衛(wèi)生間，偷偷地打開紅包，一看，壹仟圓，心里美滋滋的。高潮不想喝太多的酒，就賴在小隔間，坐在馬桶蓋上把玩手機耗時間，反正這里也很干凈，一絲兒異味都聞不到。不大會兒，就聽到外面兩個小便的人在交談。一個說，乖乖，好大方，紅包就裝了貳仟圓。另一個嚷嚷道，這狗日的梅董也太狗眼瞧人低了吧，只給了老子陸佰塊。高潮聽第一人說的時候，心中就詛咒了梅宏圖幾句，待第二個人的話一出口，高潮登時心平氣和了。

1.3.2 基因組擴增:取PCR 綠色體系(普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司)12.5 μl 反應(yīng)液。取上、下游引物(5’-CCTTCAATGGAATGGTGCAT-3’，5’-CCCTTGTAAGGCAAGTCTGG-3’)各1 μl 混勻液加入0.5 ml Eppendorf 管，加DNA 提取液3 μl 加雙蒸水使總反應(yīng)體系至25 μl。擴增條件為:94℃預(yù)變性5 min;然后94℃，60 s;55℃，50 s;72℃，50 s 擴增30 個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.3.1 基因組抽提:應(yīng)用血液基因組DNA 抽提試劑盒(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)抽提外周血DNA，實驗步驟按說明書進行。

1.2.1.4 結(jié)果判斷:輕輕將反應(yīng)管中的液體搖勻，取反應(yīng)液20 μl 置玻璃片中間，加蓋玻片，待細(xì)胞沉淀5 min 后，用相差顯微鏡閱片。結(jié)合5 個以上紅細(xì)胞的靶細(xì)胞為一個結(jié)單位，計數(shù)100 個靶細(xì)胞，計算粘附率。

1.3 紅細(xì)胞CR1 分子基因多態(tài)性檢測

1.2.1.3 加樣:取0.5 μl 紅細(xì)胞和50 μl 血漿加到靶細(xì)胞管，搖勻，37℃，水浴30 min。

1.2.1.2 靶細(xì)胞的配制:37℃溶解靶細(xì)胞，加1 ml PBS(磷酸鹽緩沖液)，充分混勻，水平離心4 000 r/min，離心5 min，棄凈上清液(勿將細(xì)胞吸掉)，加100 μl PBS 充分混勻，備用。

1.3.3 限制性內(nèi)切酶酶切:基因擴增產(chǎn)物以Hind Ⅲ酶(普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司)酶切，取6 μl 酶切反應(yīng)液與14 μl PCR 擴增物混勻，置于37℃恒溫水浴箱內(nèi)放置1 h，終止酶切。

1.1.3 對照組:患兒病程處于出疹期及神經(jīng)系統(tǒng)受累期，有手掌、足底或臀部皮疹、口腔皰疹潰瘍，患兒出現(xiàn)精神差、嗜睡、易驚、頭痛、嘔吐、煩躁、肢體抖動、急性肢體無力等表現(xiàn)，本組所有患兒均未進展至心肺衰竭前期及心肺衰竭期，共48 例。

以建筑單體為基本評價單元,結(jié)合8個關(guān)鍵影響因子,用Excel表進行統(tǒng)計.屋頂綠化資源潛力評估方法見表2．

2.2 3組患兒紅細(xì)胞免疫粘附功能與CR1 基因多態(tài)性的比較 危重組患兒的紅細(xì)胞免疫粘附功能低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表2。

2 結(jié)果

2.2 仙居縣古樹分布區(qū)類型和變型 全縣現(xiàn)有古樹中含13個屬的科為殼斗科(Fagaceae)，有1 389株，占總數(shù)的28.46%；含有6個屬的科有薔薇科(Rosaceae)、榆科(Ulmaceae)和柏科(Cupressaceae)，共有250株，占總數(shù)的5.12%；含2～5個屬的科有20科，共有3 140株，占總數(shù)的64.34%。按照世界種子植物科的分布區(qū)類型[9]和中國種子植物屬的分布區(qū)類型[10] 標(biāo)準(zhǔn)劃分，可將仙居縣古樹科和屬的分布區(qū)類型分別劃分為10、20個類型(表2)。

表1 3 組一般情況比較

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用stata 10.0 統(tǒng)計軟件，采用Wilcoxon 秩和檢驗及Fisher 確切概率法，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 3 組患兒紅細(xì)胞免疫粘附功能比較 ± s

表2 3 組患兒紅細(xì)胞免疫粘附功能比較 ± s

注:PS-C:危重組與對照組之間的差異;PS-D:危重組與死亡組之間的差異;PD-C:死亡組與對照組之間的差異

組別 紅細(xì)胞免疫粘附功能 統(tǒng)計值死亡組(n =6) 18.33 ±7.50 chi-squared with ties = 24.452 with 2 d.f ;P =0.0001危重組(n =57) 22.45 ±8.50 PS-C= 0.0000 (z = －4.307)對照組(n =48) 35.76 ±17.82 PS-D=0.0308 (z = －2.160)PD-C=0.0024 (z = －3.029)

2.3 3組之間CR1 基因多態(tài)性分布 危重組與對照組的CR1 基因多態(tài)性構(gòu)成比的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。見表3。

2.1 一般情況 危重組男37 例，女20 例;死亡組男4 例，女2 例;對照組男30 例，女18 例;危重組與死亡組患兒月齡之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。2 組患兒月齡均小于對照組，2 組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1。

表3 3 組間CR1 基因多態(tài)性分布情況 例(%)

3 討論

手足口病目前在大陸地區(qū)仍有不同范圍不同程度的流行和小暴發(fā)，尤其是重癥、危重癥患兒，易造成神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，對兒童的身心健康造成嚴(yán)重影響。我國2011 年發(fā)病人數(shù)為1 610 706 例次，死亡509 例，2012 年手足口病發(fā)病人數(shù)為2 168 737 例次，死亡567例，2013 年發(fā)病人數(shù)約1 467 694 例次，死亡約225例［2，3］。手足口病仍是嚴(yán)重威脅我國兒童生命健康的傳染病之一。

高熱、驚厥、惡心嘔吐、入院時中性粒細(xì)胞增高是重癥手足口病的危險因素，而年齡＜1 歲或＞5 歲，舒張壓偏高是保護性因素。臨床工作當(dāng)中，上述部分因素有可能受到外界環(huán)境影響，如合并呼吸道或消化道感染、患兒恐懼、劇烈哭鬧等影響［9］。重癥手足口病患兒的預(yù)后因素目前已進行了多方面研究，但引起重癥手足口病的發(fā)病機制仍未完全清楚，推測可能與病毒直接侵犯組織細(xì)胞(如腦組織)或病毒入侵所致異常免疫反應(yīng)有關(guān)。重癥致死病例可表現(xiàn)為迅速進展的交感神經(jīng)緊張、肺水腫、肺出血、心肺衰竭，研究發(fā)現(xiàn)這些患兒心功能正常、肺動脈壓力正常、外周血管阻力正常，且尸檢并未發(fā)現(xiàn)心肌炎表現(xiàn)，因此心肺衰竭、肺水腫不能完全用血液動力學(xué)改變來解釋。而廣泛的系統(tǒng)炎性反應(yīng)，釋放促炎因子參與腦干腦炎、肺水腫的形成，腦干損傷和(或)由于細(xì)胞因子釋放導(dǎo)致的系統(tǒng)炎性反應(yīng)綜合征是形成肺水腫的重要原因，如白介素(IL-6、IL-10、IL-13)、腫瘤壞死因子(TNF-α)的升高以及CD4、CD8 和NK 細(xì)胞的損耗，與致命的肺水腫關(guān)系密切［10，11］。TNF-α 和IL-6 是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，是集體免疫防護的重要介質(zhì)，但也參與集體的免疫病理損傷。TNF-α 介導(dǎo)炎癥反映的許多病理生理過程，促進炎癥細(xì)胞黏附、游走、浸潤級中性粒細(xì)胞脫顆粒，同時可以作用于單核巨噬細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)而加劇炎性反應(yīng)，引起局部的免疫反映甚至系統(tǒng)損害。HFMD 患兒體內(nèi)廣泛免疫炎性反應(yīng)，高水平的前炎性因子進而激活其他效應(yīng)細(xì)胞，引起連鎖反應(yīng)及放大效應(yīng)即瀑布效應(yīng)引起SIRS 及多臟器功能障礙綜合征。

紅細(xì)胞是血循環(huán)中重要的天然免疫細(xì)胞之一，是機體對異物和免疫復(fù)合物起免疫粘附作用的主要細(xì)胞。由于血液循環(huán)中紅細(xì)胞與白細(xì)胞之比值為(500 ～1 000)∶1，因此紅細(xì)胞與外界侵入的異物或免疫復(fù)合物相遇的機會較白細(xì)胞要高很多，在機體免疫反應(yīng)及其調(diào)控中占有重要的地位。成熟紅細(xì)胞膜表達CR1、CD44、CD58 等物質(zhì)，對循環(huán)炎性物質(zhì)具有重要的粘附結(jié)合及清除作用;其清除免疫復(fù)合物的方式主要有3 種，通過過氧化物酶直接消除粘附的抗原物質(zhì);促進吞噬細(xì)胞對抗原的吞噬;紅細(xì)胞本身不僅可以粘附免疫復(fù)合物，還可粘附自身T 細(xì)胞，將抗原提呈給T細(xì)胞，增強T 細(xì)胞的免疫功能，更有效地清除免疫復(fù)合物。本研究中，死亡組及危重組患兒紅細(xì)胞免疫粘附功能較對照組均有顯著下降，且2 組之間差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示紅細(xì)胞免疫粘附功能的不同程度的下降，導(dǎo)致對炎性介質(zhì)清除能力的下降，分別與疾病的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。對入院手足口病患兒進行紅細(xì)胞免疫粘附功能的監(jiān)測有助于了解HFMD 患兒預(yù)后，以及早進行干預(yù)，減少死亡率。

紅細(xì)胞發(fā)揮免疫功能尚需通過其表面的CR1 來進行。CR1 通過與機體內(nèi)免疫復(fù)合物(IC)結(jié)合，將其運送至肝臟、脾臟的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，以清除病灶。正常人紅細(xì)胞的CR1 呈高、中、低三種表達狀況，以HH 為主，HH 型紅細(xì)胞CR1 活性明顯高于HL 型和LL 型，是影響紅細(xì)胞免疫粘附功能的一個重要因素。CR1 的表達由CR1 基因HindⅢ酶切位點多態(tài)性遺傳決定，也與疾病有關(guān)。本研究中死亡組患兒CR1 以HL 型為主，占到50%，HH 型為33.33%，而危重組和對照組以HH 型為主，分別為77.19%、77.08%，與正常人相同。3 組之間的差異雖無統(tǒng)計學(xué)意義，但對CR1 呈中低表達的患兒尚需密切關(guān)注。

某防護結(jié)構(gòu)墻體混凝土配合比優(yōu)化及溫度控制………………………………………… 曾鳴，仲新波，揭英強（6-3）

紅細(xì)胞免疫是機體免疫的重要組成部分，近年來的研究使紅細(xì)胞免疫在免疫物質(zhì)基礎(chǔ)、免疫功能等各個方面日趨完善。紅細(xì)胞免疫粘附功能對腫瘤、糖尿病、腎病綜合征、嚴(yán)重膿毒癥等疾病具有觀察療效、判斷預(yù)后的功能，本研究提示其對于重癥手足口病預(yù)后同樣具有預(yù)警作用。

手足口病病情進展快，病死率較高，對手足口病重癥患兒的早期識別仍是挽救患兒、降低死亡率的重要預(yù)防治療方法之一，發(fā)展更多的重癥手足口病預(yù)警指標(biāo)具有重要意義。

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