楊志軍 郭永坤 張業(yè)森 戴宜武 姚學(xué)勤 徐如祥

干細(xì)胞是臨床再生替代治療極其重要的資源，干細(xì)胞移植治療多種疾病的有效性和潛能日益受到重視，有著廣闊的應(yīng)用前景［1－5］。分子影像學(xué)，特別是MR 的發(fā)展使在活體狀態(tài)下示蹤移植干細(xì)胞成為現(xiàn)實(shí)。MR 具有極其精細(xì)的組織分辨率、空間分辨率、無游離輻射和非侵襲性等特點(diǎn)，通過MR 報(bào)告基因介導(dǎo)的分子成像可以監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞的分布，動(dòng)態(tài)遷移的過程以及與宿主的整合情況。其中人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(human transferrin receptor，hTfR)報(bào)告基因在MR 分子成像中受到高度重視和廣泛的關(guān)注［6］。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建hTfR 慢病毒表達(dá)載體，為下一步以hTfR 為報(bào)告基因的活體干細(xì)胞MR 分子成像奠定基礎(chǔ)，以期為今后臨床活體示蹤干細(xì)胞提供一種新的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株:pENTR221-hTfR 質(zhì)粒購于廣州復(fù)能基因有限公司;pLENTI6.3 載體由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院張瑩瑩博士惠贈(zèng);E.coli DH5a 感受態(tài)細(xì)菌購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 主要試劑:T4 連接酶、限制性內(nèi)切酶和堿性磷酸酶購自NEB 公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA 公司;PCR 清潔試劑盒、DAN Maker 購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR 引物的設(shè)計(jì)和合成:根據(jù)Genbank 收錄的hTfR 序列(BC001188)設(shè)計(jì)引物，在上游引物的5’端加入Bamh1 酶切位點(diǎn)和Kozak 序列，下游引物的5’端加入BamH1 酶切位點(diǎn)。上游引物序列:5’’-CGCG-［GCCACC］ ATGATGGATCAAGCTAGAGAT-CAGC-3’(下劃線部分為BamH1 酶切位點(diǎn)，括號(hào)內(nèi)部分為 Kozak 序列);下游引物序列:5’-CGCG-GATCCTTAAAACTCATTGCAATGTCCCAAC-3’(下劃線部分為BamH1 酶切位點(diǎn))。引物送北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增hTfR 基因和膠回收:為保證基因克隆的正確率，采用具有高保真性和高擴(kuò)增效率的Pfu DAN 聚合酶。以pENTR221-hTfR 基因質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增hTfR。PCR 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸4 min，共25 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，按照試劑盒說明書回收目的基因。

1.2.3 重組質(zhì)粒pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP 的構(gòu)建:對(duì)空載體pLENTI6.3 和PCR 的回收目的產(chǎn)物分別用BamH1 進(jìn)行酶切，反應(yīng)條件為:37℃，4 h;在酶切反應(yīng)2 h 時(shí)用NEB 的堿性磷酸酶進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)，以減少載體自連產(chǎn)生假陽性克隆;對(duì)酶切載體進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收;酶切目的片段的純化，根據(jù)PCR 清潔試劑盒說明書進(jìn)行。將去磷酸化的酶切載體和目的片段按5∶1的摩爾比例，用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，4℃，連接過夜;次日連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a 感受態(tài)細(xì)菌，涂布氨芐(Amp)抗性LB 平板，37℃搖菌過夜培養(yǎng)。

1.2.4 克隆鑒定:轉(zhuǎn)化后，挑取單菌落，用上述設(shè)計(jì)合成好的PCR 的引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(cè)陽性菌落，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸4 min，共25 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min;PCR 產(chǎn)物行1%的瓊脂糖凝膠電泳后鑒定。挑取陽性菌落接種于5 ml Amp 抗性的LB 培養(yǎng)基中，37℃220 r/min 搖菌過夜培養(yǎng);按質(zhì)粒提取試劑說明書提取質(zhì)粒，并行BamH1 酶切，反應(yīng)條件為:37℃，4 h，酶切產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠電泳后鑒定。酶切鑒定符合理論值的質(zhì)粒菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 hTfR 基因的擴(kuò)增 以pENTR221-hTfR 為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，1%的瓊脂糖凝膠電泳可見1 條長(zhǎng)約2 283 bp 的亮帶，與理論值一致。見圖1。

圖1 hTfR PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果圖

2.2 pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP 重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和菌落PCR 鑒定 pLENTI6.3 帶有EGFP 基因，將hTfR 基因連接入pLENTI6.3 載體即為pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a 感受態(tài)細(xì)菌，涂布氨芐(Amp)抗性LB 平板，37℃搖菌過夜培養(yǎng)可見陽性菌落產(chǎn)生。挑10 個(gè)單克隆菌落，用上述hTfR 特異引物進(jìn)行菌落PCR，行1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示:克隆8 有1 條長(zhǎng)約2 283 bp 的亮帶。見圖2。

圖2 pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP 重組慢病毒表達(dá)載體菌落PCR 后電泳圖

2.3 重組載體酶切鑒定和測(cè)序 提取菌落陽性克隆8 的質(zhì)粒，行BamH1 酶切，1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示:酶切圖譜有11 條長(zhǎng)約2 283 bp 的亮帶;送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示:hTfR 基因序列正確，無突變或缺失。表明pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP 重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。見圖3。

圖3 pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP 重組慢病毒表達(dá)載體BamH1 酶切后電泳圖

3 討論

hTfR 是一種廣泛分布于細(xì)胞膜的跨膜糖蛋白，但其表達(dá)具有明顯的組織分布差異性，在高增殖的基底上皮細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞等有較高水平的表達(dá)，也在非增殖的細(xì)胞中表達(dá)，如:腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺、睪丸細(xì)精管等。hTfR 位于人的第3 號(hào)染色體，編碼區(qū)(CDS)長(zhǎng)2 283 bp。hTfR 的表達(dá)主要受細(xì)胞內(nèi)鐵的水平進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)，hTfR mRNA3＇端非編碼區(qū)存在著5 個(gè)連鎖作用的鐵效應(yīng)元件(five iron response elements，IRE)是hTfR 表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，這些鐵的效應(yīng)元件被2 種RNA 結(jié)合的鐵調(diào)節(jié)蛋白(iron regulatory proteins，IRP)識(shí)別，并控制著mRNA 的穩(wěn)定性［7］。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵不足時(shí)，IRP-1 結(jié)合IRES 增加了TfR mRNA 的穩(wěn)定性，因此TfR 的mRNA 被翻譯，增加了細(xì)胞表面的TfR。

目前干細(xì)胞活體非侵襲性示蹤的分子影像學(xué)技術(shù)主要有光學(xué)成像、核素成像和磁共振成像(MRI)等。相比其他技術(shù)，MRI 有著極其精細(xì)的空間分辨率和組織分辨率，對(duì)深層組織成像無困難，且無電離輻射，已廣泛的用于臨床;對(duì)于移植的干細(xì)胞，MRI 還可以獲得移植周圍組織的解剖和生理信息，包括移植灶周圍的水腫和炎癥，這些為臨床醫(yī)生提供了更多的信息，有助于了解細(xì)胞移植治療的各個(gè)方面［8］。以報(bào)告基因?yàn)榛A(chǔ)的MRI 具有MR 信號(hào)不會(huì)或很少受干細(xì)胞分裂的影響，且報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物可以反應(yīng)干細(xì)胞的功能和活力等優(yōu)點(diǎn)［9，10］。目前用于MRI 的報(bào)告基因有:β-半乳糖苷酶、酪氨酸酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、鐵蛋白、富含賴氨酸蛋白等，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的報(bào)告基因應(yīng)用最為廣泛［10］。hTfR 是細(xì)胞膜上的受體蛋白，與特異性配體轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)結(jié)合介導(dǎo)Fe 的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。在MR 的分子影像中，將hTfR 基因?qū)敫杉?xì)胞，干細(xì)胞過表達(dá)hTfR，與Tf 連接的磁性氧化鐵即Tf 的分子探針，通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。這樣干細(xì)胞內(nèi)磁性氧化鐵納米顆粒的蓄積，實(shí)現(xiàn)了MRI信號(hào)的逐步放大，提高了對(duì)干細(xì)胞信號(hào)的敏感性，從而獲得MR T2WI 上特征性的低信號(hào)［11］。Wang 等［12］應(yīng)用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)作為報(bào)告基因，轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)的超小順磁性氧化鐵納米顆粒的復(fù)合物(Tf-USPIO)作為MR 的報(bào)告探針，對(duì)小鼠MDA-MB-231 細(xì)胞的乳腺癌的動(dòng)物模型靜脈注射Tf-USPIO 分子探針，發(fā)現(xiàn)腫瘤MR T2 的弛豫時(shí)間比對(duì)照組顯著縮短，這表明轉(zhuǎn)鐵蛋白受體為報(bào)告基因成功的進(jìn)行了MR 活體分子成像，可以對(duì)內(nèi)皮抑制素基因的表達(dá)和治療進(jìn)行了活體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。目前的研究表明，TfR 報(bào)告基因介導(dǎo)的Tf-USPIO 分子探針的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和蓄積，能夠?qū)fR 進(jìn)行MR 基因顯像和示蹤，并可以檢測(cè)TfR 的表達(dá)水平［13－15］。

與其他病毒載體系統(tǒng)相比，慢病毒可以穩(wěn)定高效的感染分裂和非分裂細(xì)胞，無明顯免疫反應(yīng)，同時(shí)能夠轉(zhuǎn)染廣泛的組織等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體［16－18］。因此通過慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，使報(bào)告基因在靶細(xì)胞穩(wěn)定的表達(dá)，從而達(dá)到長(zhǎng)期檢測(cè)的目的。在本實(shí)驗(yàn)中，只擴(kuò)增了hTfR 編碼區(qū)2 283 bp，去除了細(xì)胞內(nèi)Fe 對(duì)的調(diào)控。采用高保真的Pfu DNA 聚合酶擴(kuò)增目的片段，減少了堿基的錯(cuò)配或突變。對(duì)于重組質(zhì)粒的鑒定，首先進(jìn)行了簡(jiǎn)單快速的菌落PCR 初步篩選鑒定，用初步篩選的陽性克隆，搖菌、小提質(zhì)粒、酶切鑒定和基因測(cè)序，結(jié)果證實(shí)pLENTI6.3-hTfRIRES-EGFP 重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建成功。

干細(xì)胞低水平表達(dá)hTfR，且受細(xì)胞內(nèi)IRE 的負(fù)反饋調(diào)節(jié)［8］，無法實(shí)現(xiàn)以hTfR 為標(biāo)記物的MR 分子影像成像。因此如果利用轉(zhuǎn)基因的方法，將hTfR 基因?qū)敫杉?xì)胞內(nèi)，使其過表達(dá)hTfR，因而干細(xì)胞可攝取較多的磁性氧化鐵納米顆粒，使其在MR T2WI 信號(hào)特異性減低，從而達(dá)到對(duì)移植后干細(xì)胞長(zhǎng)期無侵襲性的活體示蹤。我們構(gòu)建的pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP 重組慢病毒載體，還帶有EGFP 報(bào)告基因，通過組織冰凍切片的熒光顯微鏡檢測(cè)，進(jìn)行離體狀態(tài)下的EGFP 報(bào)告基因熒光成像，從而達(dá)到活體和離體檢測(cè)的相互印證。本實(shí)驗(yàn)為下一步包裝慢病毒、感染干細(xì)胞，進(jìn)行干細(xì)胞體外、體內(nèi)的MRI 活體示蹤提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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