榮文娟　劉君璞　朱迎春　鄧云　李衛(wèi)華　安國林　李可　孫德璽

摘要：為探討適宜的西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)方法，以‘大果黑美人、‘早春翠玉、‘中科6號等為試材，研究了供體植株的基因型、4℃預處理時間、35℃高溫預培養(yǎng)時間及植物生長調(diào)節(jié)劑對未受精胚珠的反應率和愈傷誘導率的影響。結(jié)果表明：不同材料（基因型）的胚珠反應率和愈傷誘導率都有顯著性差異，愈傷誘導率最高的是‘中科6號（92.3%），最低的是野生西瓜‘09005（57.2%）；4℃低溫預處理沒有顯著提高胚珠反應率和愈傷誘導率，對于胚珠反應率和愈傷誘導率的影響因培養(yǎng)基不同而不同；35℃高溫預培養(yǎng)可以提高胚珠反應率和愈傷誘導率，預培養(yǎng)3d可以得到較高的愈傷誘導率和質(zhì)量較好的愈傷組織；在誘導培養(yǎng)基MS+6-BA2mg·L^-1+NAA3mg·L^-1+TDZ0.05mg·L^-1上，愈傷誘導率最高為84.64%；植物生長調(diào)節(jié)劑TDZ相對于2，4-D和KT對西瓜未受精胚珠愈傷誘導的效果較好。

關(guān)鍵詞：西瓜；未受精胚珠；離體培養(yǎng)；愈傷組織；誘導率

西瓜是重要的經(jīng)濟作物，由于遺傳基礎(chǔ)狹窄，限制了育種工作的進展。傳統(tǒng)的育種方法品種創(chuàng)新難度大、費時費力。西瓜單倍體培養(yǎng)有利于性狀表達、快速純合基因型、獲得新的種質(zhì)資源，和傳統(tǒng)的育種方法相結(jié)合加速育種進程，拓寬了育種途徑；也可以用于分子標記、基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建等，有著極其重要的意義。通過離體誘導雌核發(fā)育和雄核發(fā)育都可以獲得單倍體，在葫蘆科作物中，黃瓜、西葫蘆、南瓜、甜瓜的離體誘導雌核發(fā)育都獲得了再生植株。西瓜通過花藥離體培養(yǎng)誘導獲得愈傷組織的報道較多，愈傷組織的誘導率較高，愈傷組織分化出再生植株的分化率低。周林對西瓜花藥和未受精子房離體培養(yǎng)進行了初步研究，也只得到了愈傷組織，沒有獲得單倍體植株。王建設(shè)等研究西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)得到了3個有再生能力的胚，其中的一個胚狀體再生出了單倍體植株。李玲等通過對西瓜未授粉子房和胚珠離體培養(yǎng)的研究，獲得了愈傷組織，沒有獲得完整的單倍體植株?；谇叭宋鞴衔词芫咧殡x體培養(yǎng)獲得單倍體的培養(yǎng)體系還沒有建立，體系之中的許多影響因素還未明確，本試驗挑取西瓜未受精胚珠為外植體，研究培養(yǎng)過程中的材料的基因型、低溫預處理時間、高溫預培養(yǎng)時間、激素對未受精胚珠離體培養(yǎng)的影響，為建立西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)獲得單倍體的培養(yǎng)體系提供參考。

1.材料和方法

1.1試驗材料

未受精胚珠離體培養(yǎng)以‘大果黑美人、‘早春翠玉、‘中科6號等7個雜交種和野生西瓜‘09005為試驗材料（表1）。材料在4月份定植于中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所試驗地，每份材料定植80株，栽培管理同大田一般管理。開花前1d下午對雌花進行套帽，早上8：00采集未受精的子房用冰盒帶回。

1.2方法

1.2.1胚珠離體培養(yǎng)取未授粉的子房，輕輕去掉子房上面的茸毛，參考西瓜花藥消毒方法在超凈工作臺上用75%（φ）的乙醇浸泡子房30s，隨后用0.1%的升汞浸泡消毒8min，再用無菌水沖洗4～5遍。把子房放在無菌的培養(yǎng)皿上，用解剖刀切成3mm左右的薄片，用無菌的解剖針挑取胚珠，輕輕放在誘導培養(yǎng)基上（蔗糖濃度為4%，瓊脂濃度為0.6%，pH為5.82-5.86）。接種后的培養(yǎng)條件：25℃左右，光照16h·d^-1，光強3000L左右。每個處理接種3皿，每皿接種胚珠25個左右，3次重復。統(tǒng)計每皿接種數(shù)、胚珠膨大轉(zhuǎn)綠的胚珠數(shù)和長出愈傷組織的胚珠數(shù)。

1.2.2低溫預處理時間的篩選

以‘中科6號開花當天未受精的胚珠為試材，分別4℃預處理0、1、2、3、4、5、6 d后，接種在1號和2號誘導培養(yǎng)基上，其他培養(yǎng)條件保持一致，統(tǒng)計胚珠反應率和愈傷組織誘導率。

1.2.3高溫預培養(yǎng)時間的篩選

以‘中科6號、‘西農(nóng)8號和野生西瓜‘09005為試材，選擇4℃預處理4d的子房，把胚珠接種在1號誘導培養(yǎng)基上，進行0、l、3、5 d高溫預培養(yǎng)，其他培養(yǎng)條件保持一致，培養(yǎng)15d查看胚珠生長狀況。

1.2.4不同激素種類的篩選

以‘中科6號為試材，接種在添加不同激素的誘導培養(yǎng)基上，統(tǒng)計胚珠反應率和愈傷誘導率，分析激素對未受精胚珠離體培養(yǎng)的影響。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Excel和SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行分析。

胚珠反應率/%=胚珠膨大轉(zhuǎn)綠的胚珠數(shù)/接種數(shù)×100；

愈傷誘導率/%=長出愈傷組織的胚珠數(shù)/接種數(shù)×100。

2.結(jié)果和分析

2.1基因型對西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)的影響

把8個不同基因型西瓜的未受精胚珠接種在誘導培養(yǎng)基上，胚珠的表現(xiàn)有顯著性差異（表2）。把未受精胚珠接種到誘導培養(yǎng)基上，剛挑取的未受精胚珠比較小，飽滿白色（圖版-1）；經(jīng)過35℃高溫預培養(yǎng)3d明顯膨大發(fā)黃，部分會褐化死亡（圖版2）；試驗中用到的材料胚珠反應率雖有差異，但普遍較高，都在90%以上。胚珠啟動發(fā)育，明顯膨大后，培養(yǎng)5d，胚珠長出少量白色或淡黃色愈傷組織，此時愈傷組織比較疏松（圖版-3）。隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織明顯增多，體積迅速膨大，暗培養(yǎng)10d轉(zhuǎn)移到光照條件下，愈傷組織由白色或者淡黃色轉(zhuǎn)為黃綠色、綠色（圖版-4），比較疏松的愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)會變得質(zhì)密。不同的基因型愈傷組織生長狀況不一樣，野生西瓜‘09005和栽培品種相比愈傷誘導率較低，‘中科6號的愈傷率高達92.30%，而野生西瓜‘09005的愈傷率只有57.20%，兩者之間的愈傷質(zhì)量相差很大。栽培品種誘導出的愈傷大多質(zhì)地疏松（圖版-4），后期培養(yǎng)中易玻璃化，野生西瓜‘09005誘導出的愈傷質(zhì)地較硬、顏色略白（圖版一5），后期培養(yǎng)容易變褐死亡。疏松黃綠色或綠色的愈傷組織在后期培養(yǎng)中可以轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)地良好的愈傷組織（圖版-6）。試驗中的栽培品種的愈傷組織經(jīng)過進一步培養(yǎng)增殖分化，而野生西瓜‘09005的愈傷組織卻在培養(yǎng)過程中易死亡，表明基因型對未受精胚珠離體培養(yǎng)的誘導有重要影響。

2.2低溫預處理時間對誘導的影響

以‘中科6號為試材進行低溫預處理，結(jié)果表明：對材料進行低溫預處理沒有顯著提高胚珠的反應率和愈傷誘導率（表3），低溫預處理時間對誘導率的影響會因培養(yǎng)基的不同而異。在1號培養(yǎng)基上，低溫預處理0-6d對胚珠的反應率和愈傷率的影響沒有顯著性差異，愈傷率以低溫預處理4d最高為44.73%。在2號培養(yǎng)基上，胚珠反應率和愈傷率在低溫處理不同時間上有顯著性差異。未經(jīng)過低溫預處理的胚珠反應率和愈傷率最高，為80.99%和25.59%，經(jīng)過低溫預處理的胚珠反應率和愈傷誘導率降低。

2.3高溫預培養(yǎng)時間對誘導的影響

以‘中科6號、‘西農(nóng)8號和野生西瓜‘09005為試材，在35℃高溫下進行不同時間的預培養(yǎng)，結(jié)果表明：高溫預培養(yǎng)時間對3種材料的胚珠反應率都沒有顯著性差異，但對愈傷組織誘導率有顯著差異（表4）?！鬓r(nóng)8號高溫不同時間之間有顯著性差異，隨高溫預培養(yǎng)時間的延長，愈傷誘導率增高，高溫5d愈傷誘導率最高為69.43%?！锌?號和野生西瓜‘09005高溫不同時間之間沒有顯著性差異，‘中科6號的愈傷誘導率在5d最高為63，99%，野生西瓜‘09005在高溫預培養(yǎng)3d時愈傷誘導率最高為52.38%。3種材料對高溫預培養(yǎng)的差異性表現(xiàn)也說明基因型在培養(yǎng)過程中起重要作用。胚珠處于35℃二高溫條件下培養(yǎng)時，胚珠迅速膨大，愈傷生長快而疏松，后期分化比較難。綜合考慮，以35℃高溫預培養(yǎng)3d為宜。在培養(yǎng)過程中，胚珠經(jīng)35℃高溫預培養(yǎng)比未經(jīng)高溫預培養(yǎng)膨大轉(zhuǎn)綠所需要的時間短。未經(jīng)過高溫預培養(yǎng)的胚珠一般3d才能看出來稍有膨大，一般5-7d胚珠顏色略為變黃。經(jīng)過高溫預培養(yǎng)的胚珠2d就有所膨大，3d就會變黃。合適的高溫預培養(yǎng)時間能增加誘導率，同時也獲得質(zhì)量較好的愈傷組織。

2.4激素對胚珠離體培養(yǎng)的影響

試驗對不同激素組合進行了篩選（表5），12號培養(yǎng)基為不添加激素的MS培養(yǎng)基。未受精胚珠在MS培養(yǎng)基上反應率最低為18.12%，且最后都褐化死亡，培養(yǎng)基中添加激素能提高未受精胚珠反應率和愈傷組織誘導率。在相同的6-BA和NAA質(zhì)量濃度下，2，4-D的質(zhì)量濃度為1mg·L^-1愈傷率最高（63.07%）；TDZ質(zhì)量濃度為0.05mg·L^-1時愈傷率最高（84.64%）；KT質(zhì)量濃度為3mg·L^-1時愈傷率最高（53.95%）。3種激素相比較，誘導未受精胚珠愈傷率的高低順序是TDZ>2，4-D>KT。

3.討論

3.1基因型對未受精胚珠的影響

在西葫蘆、黃瓜等許多種作物中證明，基因型是影響獲得單倍體植株的關(guān)鍵因素。在西瓜上，李玲等做西瓜未受精子房和未受精胚珠離體培養(yǎng)時，認為基因型在培養(yǎng)中起重要作用。劉曉輝做西瓜紫外輻射花粉誘導西瓜單倍體中也證明出胚率、植株再生率和單倍體誘導率受基因型的影響。緱艷霞等研究西瓜花藥離體培養(yǎng)認為，供體植株的基因型是影響花藥培養(yǎng)的關(guān)鍵因素?；蛐蛯φT導的影響會因作物而異，本試驗中選擇了8個不同基因型的材料，材料在反應率和愈傷組織誘導率上都有差異，與前人研究結(jié)果一致。在研究中可以選擇高反應率和愈傷率的材料進行試驗，增加誘導成功的可能性。

3.2低溫對未受精胚珠的影響

許多未受精子房或胚珠離體培養(yǎng)的研究認為低溫預處理有很重要的作用。低溫預處理是改變細胞分裂方式和發(fā)育途徑，提高胚或者愈傷組織誘導率的一種途徑。朱迎春等、羊杏平等認為4℃處理2 d能夠提高西瓜小孢子的活性。魏瑛認為低溫處理可以提高西瓜花藥愈傷組織的誘導率，針對不同的基因型進行不同的低溫預處理。魏瑛報道在做花藥培養(yǎng)時，一段時間低溫處理可以抑制花藥壁產(chǎn)生愈傷組織；在西瓜未受精離體培養(yǎng)中，誘導出的愈傷組織也可能來源于珠被細胞，需要進一步研究證明愈傷組織的來源，以抑制珠被產(chǎn)生愈傷組織。本試驗中用一個材料做了低溫預處理，比較了在兩種不同的培養(yǎng)基上的反應率和愈傷誘導率，在1號培養(yǎng)基上4℃低溫預處理并沒有顯著提高胚珠的反應率、愈傷組織誘導率，但對愈傷組織的質(zhì)量有影響；在2號培養(yǎng)基上低溫預處理不利于未受精胚珠的發(fā)育。因為基因型之間存在差異，4℃低溫預處理對不同試驗材料的影響也可能不同。低溫預處理對西瓜未受精胚珠的影響還需進一步研究。

3.3高溫對未受精胚珠的影響

許多研究表明，30℃或35℃黑暗熱激可以促進雌核發(fā)育，不同的作物熱激時間不同。G6mes-Juhfisz A等在黃瓜未受精子房離體培養(yǎng)試驗中，比較了24、28、35℃對雌核發(fā)育誘導的影響，以35℃熱激時胚胎數(shù)量最多。本試驗中，采用35℃黑暗熱激，經(jīng)過黑暗熱激的胚珠反應速度比未經(jīng)過高溫熱激的快，愈傷率得到提高，可能是高溫促進愈傷的生長。胚珠黑暗熱激時間長，會影響愈傷組織質(zhì)量。高溫條件下，愈傷組織生長速度明顯加快，但形成的愈傷組織易蓬松、水漬狀，繼代培養(yǎng)也難以轉(zhuǎn)化為質(zhì)地好的愈傷。‘中科6號和‘西農(nóng)8號的愈傷誘導率在5 d最高，但綜合考慮生長狀況，本試驗以35℃黑暗熱激3d為宜。

3.4激素對西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)的影響

未受精胚珠接種在不加任何激素的MS基本培養(yǎng)基上，胚珠全部褐化死亡。由未受精胚珠誘導出愈傷組織轉(zhuǎn)接在MS基本培養(yǎng)基上也全部褐化死亡。這說明，激素在西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)誘導過程中起關(guān)鍵作用。許多研究者認為，一定濃度的2，4-D對誘導十分必要，試驗中誘導培養(yǎng)基添加一定濃度的2，4-D能夠明顯提高愈傷組織的誘導率，但是添加一定濃度的TDZ和2，4-D相比更利于誘導出愈傷組織。最佳愈傷誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA2mg·L^-1%NAA3mg·L^-1+TDZ0.05mg·L^-1，誘導出的愈傷組織轉(zhuǎn)接到6-BA2mg·L^-1+NAA2mg·L^-1+KT2mg·L^-1的培養(yǎng)基上，愈傷生長狀況良好。

取材時間、基因型、溫度變化、培養(yǎng)基等許多因素影響西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)，這些因素之間的作用不是獨立的，只使其中的一個條件達到最優(yōu)，再和其他影響因素相互作用不一定能建立最適合西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)的體系。西瓜未受精胚珠的離體培養(yǎng)，由于取材的限制和培養(yǎng)過程漫長、重復性差等特點，所以研究過程相對緩慢。西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)時產(chǎn)生愈傷組織或者胚狀體是獲得單倍體植株的有效途徑，一般試驗中愈傷組織更易獲得，但培養(yǎng)中體細胞也有可能脫分化形成愈傷組織，所以如何抑制體細胞產(chǎn)生愈傷也是誘導成功的關(guān)鍵。在黃瓜、西葫蘆等作物的單倍體培養(yǎng)中，已經(jīng)建立了比較完整穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，而西瓜單倍體培養(yǎng)體系還在探索階段，需進一步的研究。