杜次 李菁 彭清 湯鵬 田向榮

摘 要：采用RT-PCR法，從杜仲幼嫩葉片中分離法尼烯基焦磷酸基因cDNA全長序列，克隆并對該基因全長序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。從杜仲嫩葉中共獲得兩個基因分別命名為EuFPPs1和EuFPPs2，測序結(jié)果表明兩基因開放閱讀框分別為1047bp和1029bp，推測分別可以編碼348個和342個氨基酸殘基，在線預(yù)測表明兩個蛋白序列均存在兩個聚丙烯合酶位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，EuFPPs1和EuFPPs2分別聚集于不同的分支，它們之間的進(jìn)化距離為0.352，但是在親緣關(guān)系上均與楤木和人參最近，進(jìn)化距離分別為0.281、0.287，0.175，0.184。關(guān)鍵詞：杜仲；FPPs；基因克?。恍蛄蟹治觯荷镄畔W(xué)中圖分類號：Q71

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2015）02-0100-06杜仲是新生代第三紀(jì)孑遺植物，是重要的木本藥用樹種，是我國傳統(tǒng)的中藥材[1]，現(xiàn)代醫(yī)藥研究表明，杜仲的多種活性成分主要為萜類化合物或萜類相關(guān)化合物，如環(huán)烯醚萜類的京尼平苷、京尼平苷酸及桃葉珊瑚苷，還有杜仲膠、多糖、氨基酸類、抗真菌蛋白及微量元素等，國內(nèi)外研究結(jié)果表明杜仲有降壓、調(diào)節(jié)血脂、降血糖、增強(qiáng)免疫力等功效[1-6]。 除了其寶貴的藥用價值外，杜仲更是重要的天然橡膠資源，具有重要價值的杜仲膠也是萜類化合物，杜仲膠是一種反式聚異戊二烯，為順式聚異戊二烯的同分異構(gòu)，但是理化性質(zhì)具有很大差異，杜仲膠獨(dú)具塑料二重性，是一種新型的天然高分子功能材料，在國防、橡膠工業(yè)、醫(yī)療和化工等領(lǐng)域具有非常重要的應(yīng)用價值[5，6]。因此，研究挖掘萜類生物合成途徑相關(guān)功能基因?qū)Πl(fā)展杜仲產(chǎn)業(yè)具有重要意義。湘西杜仲資源豐富質(zhì)優(yōu)，研究湘西地區(qū)杜仲膠生物合成途徑相關(guān)的功能基因，為以細(xì)胞工程為手段的杜仲膠工業(yè)化生產(chǎn)以及酶工程研究奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.試劑與材料

試劑：總RNA提取試劑RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶、DNA marker、載體pMD○R 19-T均購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；克隆宿主菌體大腸桿菌JM109由上海生工提供，引物均由上海生工合成。實(shí)驗(yàn)材料：采自本實(shí)驗(yàn)室周同的杜仲嫩葉。1.2總RNA提取及cDNA合成剪取杜仲幼嫩枝條，置于裝有干冰的泡沫盒中，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室提取葉片總RNA?？焖俜Q取約100mg杜仲幼嫩葉片，置于液氮預(yù)冷的研缽中，倒入少量液氮，迅速研磨成粉，并邊研磨邊添加液氮。采用TaKaRa公司提供的Trizol試劑，并按試劑所提供的策略經(jīng)過改良提取總RNA[7]。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，并用分光光度汁檢測RNA濃度。利用TaKaRa公司的PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，試劑盒所提供的方法將所提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈互補(bǔ)鏈DNA（cDNA）。1.3杜仲FPPs基因PCR擴(kuò)增純化及克隆

從NCBI上搜索FPPs基因序列，根據(jù)對高度相似序列的分析設(shè)計特異引物，見表1。以cDNA為模板，并以無菌水為模板做陰性對照，按照以下體系對杜仲FPPs基因進(jìn)行擴(kuò)增：10×Ex buffer5.0μL，dNTP（2.5mmol/L each）4.0μL，Primer（F）1.0μL，primer（R）1.0μL，Ex Taq 0.25μL，cDNA4.0μL，補(bǔ)加ddH2O至終體積50.0μL；PCR擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性5min；30個循環(huán)：94℃變性30s。52℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min，4℃保存。利用TaKaRa公司的Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Vei.2.0對PCR產(chǎn)物進(jìn)行割膠純化，割膠純化后電泳檢測純化DNA的質(zhì)量，并用紫外分光光度計檢測其濃度。采用TaKaRa公司提供的載體pMD○R19-T，并按其提供的方法將純化產(chǎn)物連接到載體上，轉(zhuǎn)化由氯化鈣法制備的JM 109感受太細(xì)胞，在氨芐抗性平板上進(jìn)行藍(lán)白篩選，挑取菌落經(jīng)過PCR檢測后選擇陽性克隆，培養(yǎng)陽性克隆提取質(zhì)粒送TaKaRa公司測序，測序儀為AB1公司的3730測序儀。1.4杜仲FPPs基因的cDNA序列的信息學(xué)分析FPPs基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測采用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam；FPPs基因可表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)搜索分別采用在線工具ExPASy PROSITE（http：//www.expasy.ch/prosite/）和NCBI在線工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析和結(jié)構(gòu)域的三維建模采用SWISS-MODEL （http：//swissmodel.espasy.org/）。 采用SignalP4.0 Server （http：//www.cbs，dtu.dk/servers/sigalP/）進(jìn)行分泌蛋白預(yù)測[8]；利用WOLF PSORT（http：//wolfpsort.org/）進(jìn)行蛋白定位信號預(yù)測；采用在線軟件HMMTOP（http：//www.enzim.hu/hmmtop/）對蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)域預(yù)測；通過MEGA5.2構(gòu)建氨基酸序列系列進(jìn)化樹[9]。2結(jié)果與分析2.1杜仲FPPs基因的克隆和序列分析從NCBI數(shù)據(jù)庫中，搜索多個高等植物中FPPs基因的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)存在兩個不同的序列，經(jīng)過多重比對分析，設(shè)計特異引物，以杜仲嫩葉總RNA逆轉(zhuǎn)錄所獲得的cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得的兩個基因全長序列擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為Eu FPPs1、Eu FPPs2（如圖1所示），對獲得的兩個基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，所得序列利用Vectoi，NTI軟件分析，發(fā)現(xiàn)兩個序列均具有完整開放閱讀框，長度分別為1047 bp、1029 hp。將序列進(jìn)行BLAST程序檢索，EuFPPs1基因與煙草（Nicotima tabacu.，KJ001141.1）、馬鈴薯（Solanum tuberosum..XM_006352489.1）、番茄（Solanum， lycopersicum.，XM_004248274.1）、青錢柳（Cyclocarya paliurus.，GU121224.1）、大戟（Euphorbiapekinensis.，F(xiàn)J755465.1）的相似性分別為75%、75%、75%、74%和72%；EuFPPs2與大丁草（Leibnitzia anandria.，JX424568.1）、芒果（Mangifera indica.，JN035296.1）、蒲公英（Taraxacum mongolicum.，JX424566.1）、紫花苜宿 （Medicago saliva.，CU361537.1）的相似性分別為78%、78%、78%和77%。確定EuFPPs1、EuFPPs2均為杜仲FPPs基因cDNA全長序列，CenBank登錄號為KC468-535.1、KC468536.1。2.2EuFPPsl、EuFPPs2基因編碼蛋白序列分析EuFPPsl、EuFPPs2基因經(jīng)在線翻譯分別可編碼348個和342個氨基酸殘基。利用CLUSTRAL X軟件對原核生物、藻類和高等植物FPPs行序列比對結(jié)果表明，植物FPPS具有與其他生物一樣的5個保守結(jié)構(gòu)域[10]，即：結(jié)構(gòu)域I （GKXXR）；結(jié)構(gòu)域II（EXXXXXXLXXDDXXDXXXXRRG）；結(jié)構(gòu)域III（CQXXD）；結(jié)構(gòu)域IV（KT）；結(jié)構(gòu)域IV（GXXFQXXDDXXDXXXXXXXXCKXXX DXXXXK），除原核生物中的結(jié)構(gòu)域IV（KT）不同，其他結(jié)構(gòu)域均具有很高的保守性，如圖2，其中富含天冬氨酸的聚丙烯合酶基序[11-15]（LVIDDim..DSshtRRG， MGsyFQVqDDYID），該保守序列在酶的活性催化和底物結(jié)合中其重要的功能作用。2.3Eu FPPsl、EuFPPs2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)根據(jù)ExPASy ProteomICs Server、提供的在線工具Protparam對EuFPPsl、EuFPPs2基因編碼的蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析，EuFPPs1、EuFPPs2基因編碼的蛋白理化性質(zhì)如表2。2.4EuFPPsl、EuFPPs2二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

分別對杜仲中的EuFPPs1、EuFPPs2基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明蛋白EuFPPs1主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成，占67.7%；β-折疊占7.96%，其他結(jié)構(gòu)占24.340%；EuFPPs2也主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成，占69.6%；β-折疊占9.28%，其他結(jié)構(gòu)占21.12%。

通過Prosite在線數(shù)據(jù)庫分析EuFPPs1、EuFPPs2蛋白的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)EuFPPs1蛋白序列含有5類功能位點(diǎn)，4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，2個豆蔻?；稽c(diǎn)，6個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，1個氨?；稽c(diǎn)，1個N-端糖基化位點(diǎn)；EuFPPs2蛋白序列含有4類功能位點(diǎn)，分別是1個豆蔻酰化位點(diǎn)，4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，3個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，1個酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。由SWISS-MODEL Workspace在線軟件建立的EuFPPsl和EuFPPs2蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，如圖3。2.5信號肽及亞細(xì)胞定位及跨膜區(qū)域預(yù)測使用在線軟件SignalP4.0 Server對EuFPPs1和EuFPPs2進(jìn)行預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，EuFPPs1和EuFPPs2都是非分泌蛋白；WOLFPSORT在線預(yù)測表明EuFPPs1最可能定位于細(xì)胞質(zhì)?。╟ytoplasm：10.0， nucleus： 3.0），EuFPPs2最有可能定位于細(xì)胞質(zhì)中（cytoplasm： 10.0， nucleus： 2.0， mitochondria：1.0）。經(jīng)過在線軟件HMMTOP對EuFPPs1和EuFPPs2基因可編碼的蛋白序列進(jìn)行跨膜預(yù)測發(fā)現(xiàn)EuFPPs1、FuFPPs2均無跨膜區(qū)域。2.6不同物種EuFPPs1、EuFPPs2氨基酸序列比對及進(jìn)化分析從NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫（Nr）中選取與EuFPPs1和EuFPPs2基因編碼蛋白相似性較高的34條FPPs蛋白序列。采用軟件MEGA5.2構(gòu)建ML系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖4所示。高等植物、藻類和原核生物來源的FPPs蛋白序列在進(jìn)化上分別屬于不同的分類群。EuFPPs1和EuFPPs2分別聚集于不同的分支，但是在親緣關(guān)系上均與楤木和人參最近，其中EuFPPs1與楤木和人參的進(jìn)化距離分別為0.281和0.287，EuFPPs2與楤木和人參分別為0.175和0.184。3 討論

法尼烯基焦磷酸合酶（ FPPs）是異戊二烯途徑中的重要調(diào)節(jié)酶，在植物體內(nèi)催化異戊烯基焦磷酸和牻牛兒基焦磷酸生成法尼烯基焦磷酸（FPP），是各種倍半萜化合物如脫落酸和杜松烯等的合成前體[16、17]。法尼烯基焦磷酸可經(jīng)過牻葉兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPs）合成聚異戊二烯的前體牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP），同時FPP也可直接作為前體生成聚異戊二烯。因此，F(xiàn)PPs在植物多種生物活性物質(zhì)，尤其是橡膠膠等重要的工業(yè)原料的合成中具有重要的作用。

生物信息學(xué)分析是預(yù)測基因功能的有效手段[18]。到目前為止，植物FPPS基因已分別從橡膠[19]、煙草[20]、高粱[21]、水稻[22]、刺五加[23]、丹參等40多種植物中分離克隆出來，經(jīng)過測序分析，植物FPPSmRNA長度范圍為1040～1731bp，外放閱讀框長度范同為924～1224 bp，可編碼由307～407個氨基酸組成的多肽。

成功克隆了杜仲中的兩個法尼烯基焦磷酸合成酶基因（EuFPPs1和EuFPPs2），并對其全長cDNA序列進(jìn)行測序和生物信息學(xué)分析，推測杜仲EuFPPsl和EuFPPs2基因分別可編碼348個和342個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為40.04kD和39.55kD，與已研究報道的大多數(shù)FPPs大小相同或相近。WOLFPSORT預(yù)測結(jié)果表明EuFPPs1和EuFPPs2最可能定位在細(xì)胞質(zhì)中，均含有兩個聚丙烯合酶基序。FPP合成酶是一種細(xì)胞質(zhì)二聚酶，而且無論原核生物還是真核生物，其FPPs均含有聚丙烯合酶基序，具有高度的保守性，在植物萜類化合物的生物合成中發(fā)揮重要的功能[9-13]。因此，本研究從杜仲中克隆的兩個EuFPPs均屬于FPPs基因家族，在杜仲的萜類化合物及杜仲膠的合成中發(fā)揮重要作用。

EuFPPsl和EuFPPs2相差6個氨基酸殘基，它們之間的相似性為72.4%，系統(tǒng)發(fā)育分析表明EuFPPs1與EuFPPs2聚集在同一類群不同分支，兩者間的進(jìn)化距離為0.352，而且在親緣關(guān)系上均與楤木和人參最近，其進(jìn)化距離分為0.281、0.287；0.175、0.184。據(jù)杜仲EuFPPs1和EuFPPs2間的序列差異，推測兩者可能存在功能上的差異，可能分別調(diào)控不同的分支代謝途徑，因此，EuFPPs1和EuFPPs2在杜仲中的代謝差異和分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。[1]杜紅巖.杜仲活性成分與藥理研究的新進(jìn)展[J].經(jīng)濟(jì)林研究 （DU Hong-yan. The progress in research of the active compo?nent from Eucommia ulmoides and its Pharmacologyf[J]. Economic Forest Researches），2003，21（2）： 58-61.[2]KWAN C Y， CHEN C X， DEYAMA T， el d. Endothel iumdependent vasorelaxant effects of the aqueous extracts of the Eucommia ulmoides Oliv. Leaf and bark： implication on their antihyperlensive action[J]. Vascular Pharmacol，2004，11（24）：229-235.[3] LEE G W， YON H C， BYUN S Y. Inhibitory effect of Eucommia ulmoides Oliver on adipogenic differentiation through promeanalysis[J]. Enzyme and Microbial Technology，2004，（6）： 52-638.[4]OK AD A N， SHIATA K， NIWANO M， et al. 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