劉雪靜 王艷 劉童光 張其安 方凌 段寶慧

摘 要： 為了研究低溫對(duì)番茄果實(shí)轉(zhuǎn)色關(guān)鍵酶的影響，以‘T-CRH-13番茄高世代穩(wěn)定自交系為材料，采用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)常溫和低溫條件下番茄果實(shí)成熟過(guò)程中番茄紅素含量的變化，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了番茄紅素合成相關(guān)酶（PSY1、PSY2、PDS、ZDS）基因的表達(dá)變化。結(jié)果表明：在果實(shí)成熟過(guò)程中，低溫處理組和對(duì)照組的番茄紅素含量都呈增高趨勢(shì)，處理組番茄紅素積累緩慢，且含量遠(yuǎn)低于對(duì)照組;處理組和對(duì)照組的PSY1、PSY2表達(dá)量都是先增高后降低，對(duì)照組的表達(dá)量明顯高于處理組;處理組和對(duì)照組的ZDS變化趨勢(shì)一致，都是先降低后增高;處理組的PDS先降低后升高，總體呈降低趨勢(shì)，對(duì)照組持續(xù)升高。低溫下，番茄紅素合成相關(guān)酶基因表達(dá)受抑制，番茄紅素合成和積累水平降低可能是番茄轉(zhuǎn)色困難的重要原因。

關(guān)鍵詞： 番茄; 低溫; 番茄紅素; 關(guān)鍵酶

Effect of chilling temperature on key enzyme in tomato in colour- changed period

LIU Xuejing1， WANG Yan2， LIU Tongguang1， ZHANG Qian2， FAGN Ling2， DUAN Baohui1

（1. School of Horticulture，Anhui Agricultural University， Hefei， 230036， China; 2. Anhui Academy of Agricultural Sciences， Institute of Horticulture， Hefei， 230031， China）

Abstract： In order to study the effect of chilling temperature on key enzyme in Tomato in colour-changed period，the contents of lycopene during tomato fruit development were measured. The expression of PSY1 and PSY2 and PDS and ZDS gene participated in lycopene synthetic were quantitative by real-time quantitative PCR. The results showed that the content of lycopene gradually increased in tomato fruit ripening process，lycopene accumulated slowly in treatment group，and the content was far lower than the control group;the expression levels of PSY1 and PSY2 increased during the mid-stages but decreased in the fully mature fruit and the expression level of control group was obviously higher than that of treatment group; the expression levels of PDS decreased during the mid-stages but increased in the fully mature fruit;the expression levels of ZDS decreased during the mid-stages but increased in the fully mature fruit in treatment group，the expression levels of the control group gradually increased. Under the condition of low temperature，the expression of gene participated in lycopene synthetic is suppressed，the drop of synthesis and accumulation of lycopene levels may be the important reason for the difficult in colour-changed in tomatoes.

Key words： Tomato; Chilling temperature; Lycopene; Key enzyme

番茄（lycopersicum esculentum Mill. ）是全世界栽培最為普遍的果菜之一，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，富含類胡蘿卜素、維生素C等多種營(yíng)養(yǎng)素，風(fēng)味獨(dú)特，能清熱止渴、養(yǎng)陰涼血等。其中，番茄紅素（Lycopene）是番茄果實(shí)中含量最高的一種類胡蘿卜素，具有很強(qiáng)的抗氧化能力，能有效地清除體內(nèi)自由基，可提高免疫力、延緩衰老、預(yù)防心腦血管疾病和一些癌癥，因此有“植物黃金”之稱，被譽(yù)為“21世紀(jì)保健品的新寵”。成熟番茄果皮顏色分為無(wú)色和黃色，其色素主要為胡蘿卜素;果肉顏色為紅色和黃色，其中紅色果肉含番茄紅素，黃色果肉含胡蘿卜素;無(wú)色果皮與紅色果肉其果實(shí)顏色表現(xiàn)為粉紅，黃色果皮與紅肉其果色表現(xiàn)為紅色[1]。粉紅色及紅色番茄在生產(chǎn)上占據(jù)主導(dǎo)地位，番茄紅素含量是決定此類番茄果實(shí)外觀色彩的最主要類胡蘿卜素。

目前，植物番茄紅素生物合成途徑已經(jīng)闡明，其中的關(guān)鍵酶基因也已經(jīng)被克隆[2]，并應(yīng)用于植物類胡蘿卜素調(diào)控的研究[3-4]。番茄紅素的生物合成受到遺傳和環(huán)境因子的共同調(diào)控，也受到許多內(nèi)源分子如光敏色素、乙烯的調(diào)節(jié)[5]。溫度對(duì)番茄紅素合成的影響和對(duì)果實(shí)形成的影響相似，當(dāng)溫度低于10 ℃或高于30 ℃ 時(shí)，番茄紅素的合成受到抑制[6]，當(dāng)溫度降到14 ℃ 以下時(shí)番茄紅素的合成活性顯著下降，在溫度高于32 ℃ 時(shí)活性被完全抑制，在18～26 ℃之間合成活性最高[7]。

番茄低溫轉(zhuǎn)色難，是番茄生產(chǎn)上一直存在的問(wèn)題，嚴(yán)重影響了果實(shí)外觀品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。前人對(duì)番茄轉(zhuǎn)色的關(guān)鍵色素——番茄紅素的相關(guān)研究雖深入持久，但缺乏對(duì)低溫條件下番茄紅素代謝相關(guān)的酶基因的動(dòng)態(tài)變化的系統(tǒng)研究。本研究通過(guò)分析番茄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中番茄紅素合成相關(guān)酶基因的變化情況，以期找出低溫條件下影響番茄紅素含量的關(guān)鍵物質(zhì)（酶），為針對(duì)性地調(diào)控相關(guān)物質(zhì)或相關(guān)酶，最終解決低溫條件下番茄轉(zhuǎn)色慢這一對(duì)生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響的難題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

‘T-CRH-13番茄高世代穩(wěn)定自交系來(lái)源于安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所育種室。

1.2 試驗(yàn)方法

供試材料在2013年8月1日播種于安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所試驗(yàn)地，穴盤育苗，8月30日定植。試驗(yàn)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，試驗(yàn)組大棚栽培，對(duì)照組栽培于空調(diào)室，保持白天25 ℃，夜間17 ℃。栽培管理水平一致。番茄果實(shí)成熟期分為5個(gè)時(shí)期：青熟期（綠熟果），果實(shí)基本停止生長(zhǎng)，果頂白，尚未著色;轉(zhuǎn)色期（頂紅果），果頂部由綠白色轉(zhuǎn)為淡黃至粉紅色;半熟期（半紅果），果實(shí)表面約一半著色;堅(jiān)熟期（紅熟的硬果），整果著色，肉質(zhì)較硬;完熟期（軟熟期），果實(shí)全部著色，肉質(zhì)變軟。果實(shí)進(jìn)入青熟期開始采樣，取第2或第3穗果，每個(gè)時(shí)期取5個(gè)果實(shí)。分別采用分光光度計(jì)法和real-time實(shí)時(shí)熒光定量法測(cè)定番茄紅素的含量和酶的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.1 番茄紅素的測(cè)定 （1）番茄紅素的提取與測(cè)量：取10 g果實(shí)勻漿，加入氯仿萃取，減壓濾去組織殘?jiān)?，并將濾液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入氯仿分多次沖洗，定容到50 mL容量瓶中，以氯仿為空白，在518.8 ?nm測(cè)定吸光值，進(jìn)行番茄紅素含量的計(jì)算。3次重復(fù)。（2）番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取經(jīng)真空干燥（45 ℃、30 min）的番茄紅素純品0.35、0.65、0.95、1.3、1.5、1.95、2.05 mg，分別在50 mL容量瓶中用氯仿溶解并定容，在518.8 nm處測(cè)其吸光度值，以吸光度值對(duì)番茄紅素的質(zhì)量濃度作圖，得到番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1。

圖1 吸光度值對(duì)番茄紅素質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定 試驗(yàn)樣品采集后，迅速用液氮凍存，保存于-80 ℃ 超低溫冰箱中備用。研缽和研棒經(jīng)200 ℃ 烘箱處理8 h，其他試驗(yàn)器材經(jīng)0.1% DEPC處理12 h，通風(fēng)櫥操作。Trizol法提取RNA。利用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（寶生物）合成cDNA第一鏈，步驟如下：

在PCR管中加入總RNA、Random Primer（N）6各1 μL，Rnase-free ddH2O 10 μL，混勻后短暫離心，70 ℃水浴5 min，立即冰浴10 s，短暫離心。在上述混合物中加入5×Reaction Buffer 4 μL、Rnase Inhibitor 1 μL、dNTP 2 μL，混勻后置37 ℃水浴5 min。再加入1 μL M-MuLV Reverse Transcriptase，使終體積為20 μL。將上述混合物置于37 ℃水浴60 min，70 ℃ 孵育10 min終止反應(yīng)。-20 ℃保存待用。

基因的相對(duì)定量分析采用ABI（Applied Biosystems）7500 Real Time PCR System進(jìn)行，所用引物見表1，每個(gè)基因3次重復(fù)。以Actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)采用Excel和DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄紅素的質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系

由圖 1可以看出，番茄紅素的質(zhì)量濃度與吸光度（518.8 nm波長(zhǎng)處）的關(guān)系為一條直線，其直線方程為c=3.6483A-0.2034，顯示出良好的線性關(guān)系。

2.2 番茄果實(shí)不同成熟期番茄紅素含量的變化

番茄果實(shí)不同成熟期番茄紅素含量的變化見圖2，常溫和低溫條件下，番茄果實(shí)中番茄紅素含量在發(fā)育成熟過(guò)程中均逐漸升高。常溫下的番茄紅素含量明顯高于低溫下的，且番茄紅素積累迅速，并在堅(jiān)熟期番茄紅素積累最快，完熟期番茄紅素的含量約是青熟期的32倍。低溫下番茄紅素積累緩慢，堅(jiān)熟期積累效率最高，青熟期幾乎測(cè)不到番茄紅素;低溫下完熟期番茄紅素的積累量約是常溫下的1/9，僅與常溫下轉(zhuǎn)色期的含量相當(dāng)。

圖2 番茄果實(shí)各成熟期的番茄紅素含量

2.3 番茄果實(shí)不同成熟期的PSY1、PSY2、PDS和ZDS基因表達(dá)變化

由圖 3可知，PSY1與PSY2基因的表達(dá)模式非常相似。常溫條件下，從青熟期到半熟期，這2個(gè)基因的表達(dá)量都是穩(wěn)步增加，到半熟期表達(dá)水平達(dá)到最高，然后逐步下降，這為堅(jiān)熟期番茄紅素的快速積累做準(zhǔn)備，與番茄紅素在堅(jiān)熟期積累效率最高相吻合。PSY1與PSY2在低溫條件下表達(dá)模式同常溫下類似，也是先增加后減少，只是在完熟期略微上升。但是，在低溫條件下，從轉(zhuǎn)色期開始，無(wú)論P(yáng)SY1還是PSY2基因的表達(dá)量均明顯低于常溫對(duì)照，且整個(gè)成熟過(guò)程中表達(dá)水平均較低。值得注意的是，從轉(zhuǎn)色期到堅(jiān)熟期為番茄紅素在果實(shí)中迅速積累的關(guān)鍵時(shí)期，PSY1與PSY2的表達(dá)量均顯著低于常溫對(duì)照。

常溫下，PDS相對(duì)表達(dá)量逐漸增加，完熟期達(dá)到最高，與番茄紅素含量變化一致。低溫下，PDS相對(duì)表達(dá)量先降低后升高，總體呈降低趨勢(shì)，青熟期PDS表達(dá)量最高。常溫和低溫條件下ZDS的相對(duì)表達(dá)量都是先降低后升高，總體呈升高趨勢(shì);常溫和低溫條件下的ZDS相對(duì)表達(dá)量差別不大，常溫下略高。但值得注意的是在低溫下，從半熟期到堅(jiān)熟期，PDS與ZDS呈明顯下調(diào)趨勢(shì)，特別是在堅(jiān)熟期，它們的表達(dá)量顯著低于常溫對(duì)照。

圖3 番茄果實(shí)各成熟期的PSY1、PSY2、PDS

和ZDS的相對(duì)表達(dá)情況

3 討 論

通過(guò)上述分析表明，正常條件下，番茄果實(shí)在轉(zhuǎn)色期開始迅速積累番茄紅素，而半熟期到堅(jiān)熟期番茄紅素積累速率最快，到堅(jiān)熟期番茄紅素含量基本穩(wěn)定。低溫條件下，番茄果實(shí)番茄紅素積累速率明顯受到抑制，從轉(zhuǎn)色期到完熟期果實(shí)番茄紅素含量積累嚴(yán)重不足，導(dǎo)致番茄果實(shí)不能轉(zhuǎn)紅。

PSY基因是類胡蘿卜素代謝途徑中第一個(gè)限速酶基因。本研究結(jié)果顯示PSY1與PSY2在低溫條件表達(dá)水平明確受抑制，這可能會(huì)導(dǎo)致番茄紅素合成的前體物質(zhì)八氫番茄紅素（phytoene）嚴(yán)重不足;同時(shí)在番茄果實(shí)積累番茄紅素的關(guān)鍵時(shí)期（半熟期到堅(jiān)熟期），PDS和ZDS的相對(duì)表達(dá)水平也受低溫抑制，導(dǎo)致番茄紅素合成受阻。因此，低溫條件下，番茄紅素合成的前體物質(zhì)八氫番茄紅素合成不足，同時(shí)番茄紅素合成相關(guān)酶基因PDS和ZDS表達(dá)受抑制，因此番茄紅素合成和積累水平降低是番茄轉(zhuǎn)色困難的重要原因。

參考文獻(xiàn)

[1] ? ?徐鶴林，李景富. 中國(guó)番茄[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007.

[2] ? ?鄒禮平，高和平，鐘亞琴. 植物番茄紅素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（33）：16232-16233，16242.

[3] ? ?Wurbs D，Ruf S，Bock R. Contained metabolic engineering in tomatoes by expression of carotenoid biosynthesis genes from the plastid genome[J]. Plant Journal，2007，49（2）： 276-288

[4] ? ?趙文恩，李艷杰，崔艷紅，等. 類胡蘿卜素生物合成途徑及其控制與遺傳操作[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（5）： 930-942.

[5] ? ?Steven K，Clinton M D. Lycopene：Chemistry，biology，and implications for human health and disease[J]. Nutrition Reviews，1998，56（2）： 35-51.

[6] ? ?Yang R F，Cheng T S，Shewfelt R L. The effect of high temperature and enthylene treatment on the ripening of tomato[J]. Joural of Plant Physiology，1997，136： 368-372.

[7] ? Robertson G，Mahoney N. Reglation of lycopene formation in cell suspension culture of VENT tomato by CPTA， growth regulation，sucrose，and temperature[J]. Journal of Experimental Botany，1995，46： 667-671.