張利宣，曲 藝

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北 石家莊 050000； 2.河北省醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所，河北 石家莊 050000）

食管癌是較常見的惡性腫瘤［1］，旺盛的增殖能力及無控性生長是惡性腫瘤的共同特點(diǎn)，研究食管癌的發(fā)生機(jī)制對于食管癌早期診斷及治療具有重大意義。筆者利用流式細(xì)胞術(shù)檢測食管鱗癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞分裂周期（cell division cycle，CDC）25A蛋白表達(dá)水平，探討細(xì)胞增殖與食管癌發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系，利用細(xì)胞試驗(yàn)研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）抑制食管癌細(xì)胞Ec9706增殖及調(diào)控CDC25A蛋白作用，以期為臨床研究低毒、高效的抗食管癌藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑與儀器、細(xì)胞株：EGCG（美國Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；碘化丙啶（美國Sigma公司）。鼠抗人CDC25A單克隆抗體（克隆系 DCS-120，美國 Santa Cruz公司）。Epics-XL型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）。人食管癌Ec9706細(xì)胞株（由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈，本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)）。接種細(xì)胞于含10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中（補(bǔ)充青霉素、鏈霉素各100 U/L），培養(yǎng)器皿置37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

臨床標(biāo)本：選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科2005年9月至2006年5月手術(shù)切除食管癌標(biāo)本38例，患者術(shù)前均未經(jīng)任何抗癌治療，均有完整的病理資料。其中男22例，女16例；年齡40～76歲；經(jīng)病理醫(yī)師證實(shí)均為進(jìn)展期食管鱗狀細(xì)胞癌。另取20例切緣正常食管黏膜組織作為對照。標(biāo)本用70%乙醇固定。

1.2 方法

單細(xì)胞懸液制備：將食管癌或正常組織利用網(wǎng)搓法制備單細(xì)胞懸液，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，保證細(xì)胞完整細(xì)胞好，細(xì)胞碎片少，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×107/mL。

分組及藥物干預(yù)：取對數(shù)生長期的Ec9706細(xì)胞1×106接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同質(zhì)量濃度的EGCG，使終質(zhì)量濃度分別達(dá)到 0，100，200，300mg/L，對照組使用生理鹽水代替EGCG（即0mg/LEGCG），作用24 h后，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，300目尼龍網(wǎng)過濾制備成合格的單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×107/mL，70%乙醇固定，4℃冰箱放置備檢。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞增殖檢測：Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司），激發(fā)光源為15mW氬離子激光器，激發(fā)波長為488nm，應(yīng)用Expo 32 ADC分析免疫熒光數(shù)據(jù)，用Muticycle AV分析軟件對DNA細(xì)胞周期擬合分析。檢測前以flow-check TMF luorpheres（10 μm）熒光微球 （REF 6605359.Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA92835.）作為標(biāo)準(zhǔn)樣品調(diào)整儀器CV值在2%以內(nèi)。取上述制備的單細(xì)胞懸液100μL（含1×106細(xì)胞）。冷PBS洗滌細(xì)胞1次，去上清，向細(xì)胞中加入碘化丙啶500μL，4℃冰箱內(nèi)避光染色30min，冷PBS洗滌細(xì)胞1次，去上清，加1mL PBS懸浮細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞增殖狀態(tài)以增殖指數(shù)（proliferation index，PI）表示，PI＝ （S+G2/M）/（G0/1+S+G2/M）×100%。

細(xì)胞CDC25A蛋白表達(dá)檢測：取制備的單細(xì)胞懸液100μL（含1×106細(xì)胞），PBS洗滌1次，去上清，向其中加入CDC25A抗體100μL，避光室溫放置30 min，PBS洗滌細(xì)胞1次，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液100μL，避光室溫孵育30min，PBS洗滌細(xì)胞1次，上機(jī)檢測前加入PBS 1 mL，經(jīng)500目銅網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀檢測。CDC25A蛋白表達(dá)以平均熒光強(qiáng)度表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 食管癌及正常組織細(xì)胞增殖及CDC25A蛋白表達(dá)水平

食管癌細(xì)胞增殖指數(shù)為（24.92±11.01）%，與食管正常組織細(xì)胞增殖指數(shù)（14.49 ±3.83）%相比顯著增高（P＜0.05），見圖 1。食管癌組織細(xì)胞中CDC25A蛋白表達(dá)量為（558.201 5±45.673 8）%，與食管正常組織細(xì)胞中CDC25A蛋白表達(dá)量（508.802 4±53.322 7）%相比顯著增高（P＜0.05），見圖 2。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同食管組織細(xì)胞周期

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同食管組織細(xì)胞中CDC25A蛋白表達(dá)量

2.2 EGCG作用后Ec9706細(xì)胞增殖及CDC25A蛋白表達(dá)水平

100，200，300mg/LEGCG 作用 24 h后，Ec9706細(xì)胞增殖指數(shù)分別為（34.14 ±2.06）%，（25.66 ±1.68）%，（18.32 ±1.07）%，與對照組 （41.24±1.13）% 相比顯著降低（P＜ 0.05）。300 mg/L EGCG組細(xì)胞增殖指數(shù)顯著低于 100，200 mg/L EGCG組（P＜0.05）。100，200，300mg/LEGCG 作用 Ec9706 細(xì)胞 24 h 后，細(xì)胞中 CDC25A蛋白表達(dá)量分別為 （574.31±4.61）% ，（551.59±6.10）%，（532.70 ±6.42）%，與對照組（595.87 ±3.73）%相比顯著降低（P＜0.05）。300mg/LEGCG組細(xì)胞中CDC25A蛋白表達(dá)量顯著低于 100，200mg/LEGCG 組（P＜0.05）。

3 討論

細(xì)胞增殖的紊亂在惡性腫瘤的發(fā)生中起著一定作用。細(xì)胞增殖受一系列因子的調(diào)控［2-3］，細(xì)胞周期調(diào)控的核心是一組蛋白激酶，即細(xì)胞周期蛋白依賴性激（CDKs）［4-5］。它們各自在細(xì)胞周期內(nèi)特定的時(shí)間激活，通過對相應(yīng)底物磷酸化，驅(qū)使細(xì)胞完成細(xì)胞周期。CDKs的激活首先需與cyclin結(jié)合成cyclin/CDK復(fù)合物，此外還受到幾種復(fù)雜機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)控，包括細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、CDK 激活性激酶 （CAK）機(jī)制、CDK 抑制物（CKI）機(jī)制和Weel/CDC25 機(jī)制等［6］。CDC25A是 CDC25 家族成員，研究表明CDC25A在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，如卵巢癌、乳腺癌等，被認(rèn)為是癌基因，在細(xì)胞周期G1至S期和G2至M期中發(fā)揮作用［7-8］。CDC25A過度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞生長失控后惡性轉(zhuǎn)化［9］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，食管癌細(xì)胞增殖呈旺盛狀態(tài)，且CDC25A蛋白過度表達(dá)，提示CDC25A蛋白高表達(dá)可能是引起食管癌細(xì)胞增殖旺盛的原因之一，并參與了食管癌的發(fā)生。

食管癌目前的主要治療方法包括手術(shù)、放射治療及化學(xué)治療，手術(shù)往往是首選的治療方法，但對于中晚期或由于其他原因不能手術(shù)的患者，多選擇放射、化學(xué)治療。由于化學(xué)治療藥物的高毒副作用及易耐藥，效果不佳，故尋找高效低毒的抗食管癌藥物，顯得格外重要。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，EGCG是綠茶的提取物，具有低毒副作用的特點(diǎn)，EGCG對多種腫瘤細(xì)胞具有生長抑制作用［10］，但用于食管癌的研究尚少見。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG作用后食管癌細(xì)胞增殖受抑制，提示EGCG可以抑制食管癌細(xì)胞生長，且可以下調(diào)CDC25A的表達(dá)水平。EGCG可能通過下調(diào)食管癌Ec9706細(xì)胞中CDC25A表達(dá)，從而抑制食管癌細(xì)胞生長，起到抗食管癌作用，且EGCG具有低毒副作用的特點(diǎn)，可作為抗食管癌藥物開發(fā)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

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