陸 偉 ，林 婧 ，徐秀秀 ，桂 鳴

（1.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 210029； 2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 泰安 271000）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM－MSCs）近來(lái)被廣泛用于治療缺血性心臟病[1－2]。前期研究證實(shí)，與反復(fù)傳代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(PR－MSCs)在小鼠急性心肌梗死后具有更好的心肌修復(fù)作用及更強(qiáng)的心功能改善能力，但細(xì)胞沒(méi)有經(jīng)過(guò)反復(fù)傳代擴(kuò)增，獲得的細(xì)胞數(shù)量不足[3－4]。因此，要想在臨床應(yīng)用 PR－MSCs，應(yīng)尋找一種途徑來(lái)獲得更多的種子細(xì)胞[5－6]。1－磷酸鞘氨醇(sphingosine－1－phosphate，S1P)由鞘氨醇激酶(sphingosine kinase，SPK)催化鞘氨醇(sphingosine，Sp)生成[7]，既是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使分子，又可分泌至細(xì)胞外，與受體結(jié)合后激活 ERK/MAPK，PI3K－Akt等信號(hào)途徑，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)效應(yīng)，并介導(dǎo)血管生成、炎癥反應(yīng)等病理生理過(guò)程[8－9]。因此，本研究中利用 S1P預(yù)處理 PR－MSCs，期望 S1P能促進(jìn)PR－MSCs增殖，在體外能得到數(shù)量足夠的PR－MSCs用于移植，發(fā)揮修復(fù)損傷心肌、改善心臟功能的作用，同時(shí)研究S1P促進(jìn)PR－MSCs增殖與分化的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

除特別說(shuō)明外，本研究中使用的試劑和耗材均來(lái)自Life Technologies，R＆D，Millipore and Biolnd。用于分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞C57BL/6J野生型小鼠，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心。

1.2 方法

PR－MSCs的分離培養(yǎng)與S1P預(yù)處理：取C57BL/6J野生型小鼠，斷頸處死，取雙側(cè)股骨和脛骨。用注射器緩慢將骨髓沖進(jìn)試管，制備骨髓單細(xì)胞懸液。擴(kuò)增培養(yǎng)于加入10%胎牛血清的DMEM中，置培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)1 d后，將非貼壁細(xì)胞懸浮，移入另一培養(yǎng)皿中，按同樣的方法反復(fù)轉(zhuǎn)移4次。在移去非貼壁細(xì)胞后的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至第10天止，得到 PR－MSCs。

分組：S1P預(yù)處理組（S1P－PR－MSCs），在種子細(xì)胞貼壁后，于培養(yǎng)液中加入 1 μmol/L S1P。對(duì)照組（PR－MSCs），細(xì)胞無(wú)藥物干預(yù)。

流式細(xì)胞技術(shù)鑒定PR－MSCs表面抗原：干細(xì)胞通過(guò)針對(duì)CD29，CD34，CD45和 CD90特異性的 FITC結(jié)合抗體標(biāo)記，通過(guò) FACSCalibur體系（BD，San Jose，CA）進(jìn)行處理。一抗為 Anti－Integrin beta 1 antibody[MEM－101A](FITC)(Abcam，ab21845)，Anti－CD34antibody[4H11[APG]](FITC)(Abcam，ab18227)，Anti－CD451 antibody[A20](FITC)(Abcam，ab24917)，Anti－CD90/Thy1antibody[FITC.MRCOX－7](FITC)(Abcam，ab226).

S1P對(duì)PR－MSCs的細(xì)胞毒性測(cè)定：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，分于96 孔板，1×104/孔，加入不同質(zhì)量濃度的藥物(0.09，0.27，0.81，2.43，7.29，21.9，61.5 μg /mL)，處理 3 d，每孔加入 180 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入 20 μL 四甲基偶氮唑鹽（MTT）溶液（5 g /L，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后終止培養(yǎng)，離心（1000 r/min，10 min），小心地吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）、對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。

PR－MSCs增殖檢測(cè)：將PR－MSCs和S1P－PR－MSCs分別于 24，48，72 h時(shí)進(jìn)行收集，采用 CCK－8測(cè)定法（YEASEN）進(jìn)行細(xì)胞增殖的分析。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）：所有的RNA由RNeasy小型試劑盒（Qiagen）收集的樣品提取。使用PrimeScript?RT試劑盒（Perfect Real Time，TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PT－PCR 反應(yīng)使用SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(Perfect Real Time，TaKaRa)和 7500 Real－Time PCR System(Applied Biosystems)進(jìn)行。對(duì)于每個(gè)樣品，循環(huán)閾（CT）由于次重復(fù)試驗(yàn)獲得。靶基因的相對(duì)表達(dá)水平使用的2－ΔΔCT方法進(jìn)行分析。

表1 引物設(shè)計(jì)

蛋白免疫印跡（Western Blot）測(cè)定：細(xì)胞提取物和培養(yǎng)基的制備如先前所述，提取蛋白，于10%SDS－PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，并在4℃含5%BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS)溫育過(guò)夜。一抗為 Anti－AKT1(phospho S473)antibody(Abcam，ab66138)， Anti－Erk1(pT202/pY204)＋Erk2(pT185/pY187)antibody(Abcam，ab76165)。用單克隆抗體（Sigma，T5201）測(cè)定 β 微管蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。RT－PCR相關(guān)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行 t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S1P對(duì)PR－MSCs無(wú)細(xì)胞毒性

根據(jù)相應(yīng)的S1P質(zhì)量濃度繪制出對(duì)數(shù)濃度抑制率散點(diǎn)圖（圖 1A），根據(jù)計(jì)算公式繪制出終質(zhì)量濃度抑制回歸曲線圖（圖 1B）。結(jié)果表明試驗(yàn)質(zhì)量濃度（1 μg/mL）S1P 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯毒性影響。

表2 S1P促進(jìn)PR－MSCs增殖的研究結(jié)果（%）

2.2 S1P促進(jìn)PR－MSCs的增殖

結(jié)果見(jiàn)表 2和圖 2。PR－MSCs的增殖活性經(jīng)S1P預(yù)處理后顯著增強(qiáng)。

圖1 試驗(yàn)質(zhì)量濃度下S1P對(duì)PR－MSCs的作用

圖2 S1P對(duì)PR－MSCs增殖的促進(jìn)作用

對(duì)經(jīng)VEGF誘導(dǎo)7d的PR－MSCs中內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)基因的檢測(cè)，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，S1P－PR－MSCs組中表達(dá)VEGF的 mRNA和 Angiopointin－1在一個(gè)較高的水平（圖 3A，3B），S1P可促進(jìn)PR－MSCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞。

2.3 S1P促進(jìn)PR－MSCs經(jīng)VEGF誘導(dǎo)為內(nèi)皮細(xì)胞

B.Angiopointin－1 mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)圖3 S1P對(duì)PR－MSCs經(jīng)VEGF誘導(dǎo)為內(nèi)皮細(xì)胞的促進(jìn)作用

2.4 S1P對(duì)PR－MSCs增殖分化影響的信號(hào)通路

在兩組PR－MSCs中檢測(cè)到P－ERK1/2和P－AKT的存在，比較發(fā)現(xiàn)，處理組中 P－ERK1/2高表達(dá)于 S1P－PR－MSCs組，但P－AKT組間沒(méi)有顯著性差異（圖4）。這表明S1P可能通過(guò)ERK通路影響PR－MSCs的增殖和分化。

圖4 P－ERK1/2的表達(dá)檢測(cè)

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞，從而修復(fù)損傷的心肌并改善心功能，因此在體外高效率地獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以供臨床應(yīng)用尤為重要[10]。反復(fù)傳代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在心肌修復(fù)中的作用并不十分顯著[11－12]，PR－MSCs在改善小鼠心肌梗死后心功能方面具有更好的表現(xiàn)。但種子細(xì)胞沒(méi)有經(jīng)過(guò)反復(fù)傳代擴(kuò)增，獲得的細(xì)胞數(shù)量不足[13]。動(dòng)物試驗(yàn)可通過(guò)取更多的骨髓來(lái)解決，但臨床患者的骨髓有限，故PR－MSCs要想在臨床推廣，還應(yīng)尋找一種途徑來(lái)獲得更多的種子細(xì)胞。另外，移植的干細(xì)胞絕大部分會(huì)死亡，在心臟原位表達(dá)很少，因此限制了干細(xì)胞修復(fù)壞死心肌的作用[14－15]。

S1P是一種與細(xì)胞生命活動(dòng)密切相關(guān)的物質(zhì)，有刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞凋亡的作用。VEGF是促進(jìn)血管生長(zhǎng)最有效的細(xì)胞因子，通過(guò)對(duì)經(jīng)VEGF誘導(dǎo)7 d后S1P－PR－MSCs組高表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因的研究，表明經(jīng)S1P處理的PR－MSCs更易內(nèi)皮化。S1P與受體的結(jié)合，可激活ERK/MAPK和 PI3K－Akt信號(hào)通路，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移及其他生物作用，如血管生成和炎癥過(guò)程。筆者發(fā)現(xiàn)，S1P－PR－MSCs中的 P－ERK1/2被激活顯著，但不是P－AKT，表明S1P通過(guò)ERK信號(hào)通路促進(jìn) PR－MSCs的增殖和分化。

由本研究可見(jiàn)，S1P能促進(jìn)PR－MSCs增殖、分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，還可能通過(guò)ERK通路影響PR－MSCs的旁分泌，并發(fā)揮作用。這將促進(jìn)PR－MSCs的臨床應(yīng)用，以及對(duì)S1P作用機(jī)制的了解。臨床心血管病，(電子信箱)luweixnk＠ 163.com；桂鳴（1957－），男，博士研究生，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾牧λソ摺⒐跔顒?dòng)脈粥樣硬化性心臟病及婦女心臟病，本文通訊作者，（電子信箱）guimingsrm＠ 163.com。

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